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    Aspectos da função fagocitária e da imunidade inata em pacientes com doença de behçet
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2014-09-24) Perazzio, Sandro Felix [UNIFESP]; Andrade, Luiz Eduardo Coelho Andrade [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introdução: Não está claro se a hiper-reatividade neutrofílica na doença de Behçet (DB) é constitutiva. Tampouco foi determinado se é induzida por algum fator solúvel sérico ou tecidual. A hipersensibilidade ao Streptococcus sanguinis sugere que infecções devam desempenhar um papel na patogênese. Devido a semelhanças clínicas e fisiopatológicas, postula-se que a DB também seja uma doença autoinflamatória. Estudos prévios sugerem o papel de fatores plasmáticos na hiperatividade neutrofílica da DB. A via do NF-B modula várias das funções dos fagócitos, porém não há descrições do seu estado de ativação na DB. Objetivos: avaliar aspectos de ativação celular em neutrófilos e células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de pacientes com DB ativa (DBa) e inativa (DBi). Materiais e métodos: quatro grupos: DBa (n=53); DBi (n=49); sepse (n=25); controles saudáveis (CS; n=50). A atividade da DB foi estabelecida com a pontuação igual ou superior a 2 no “simplified Behçet’s Disease Current Activity Form” validado para o português. Análise por citometria de fluxo avaliou: 1) a fagocitose de zimosan, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguinis e Candida albicans; 2) o metabolismo oxidativo por diidrorrodamina (DHR) antes e após estímulo com forbol miristato acetato (PMA); 3) a ativação de fagócitos mediante liberação de CD62L (shedding) após estímulos de ligantes de “toll-like receptors” (TLR)-2, -3, -4, -5, -7; 4) expressão de NF-B-p65 fosforilado pós-estímulo com PMA, TLR-3/7, plasma de CS, DBa ou DBi; 5) expressão proteica das subunidades GP-91, p22, p40, p47 e p67 da NADPH-oxidase antes e após estímulo com PMA, plasma de CS, DBa ou DBi. Foi avaliada a atividade microbicida contra S. pneumoniae, S. sanguinis, C. albicans, por meio da técnica de redução do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-thiazolil)-2,5-diphenil-2H-tetrazolio (MTT) e leitura por ELISA. O sobrenadante de culturas de CMSP com estímulo por TLR ou patógenos foi usado para determinação por ELISA de TNF, IFN, IL12p70, IL23, IL6 e IL10. O sobrenadante de culturas de neutrófilos com estímulo por PMA, lipopolissacarídeo (LPS) ou patógenos foi usado para determinação por ELISA de IL1β e IL8. A produção de H2O2- e O2ꜙ foi determinada pela intensidade de luminescência de luminol/lucigenina pós-estímulo com PMA, S. pneumoniae, S. sanguinis, C. albicans ou plasma CS, DBa ou DBi. Foi avaliada a expressão gênica das cinco subunidades da NADPH-oxidase de neutrófilos e CMSP por qRT-PCR. A produção das armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) foi quantificada após sedimentação das células em lamínulas e tratamento com PMA ou plasma humano (CS, DBa e DBi), seguida da marcação com anticorpos anti-histonas e anti-elastase e DNA (Hoechst). As concentrações plasmáticas da alarmina “high mobility group box 1” (HMGB1) foram determinadas por ELISA e as de 64 citocinas e 13 receptores solúveis por Luminex. Resultados: A função fagocítica, a atividade microbicida e o metabolismo oxidativo por DHR em PMN e monócitos não mostraram diferenças entre os quatro grupos. Os neutrófilos e os monócitos ativados no ensaio de shedding mostraram maior ativação por TLR-3 em DBi e DBa do que nos controles e nos sépticos. Houve tendência estatística para menor ativação por TLR-7 em monócitos de DBi e DBa do que nos sépticos. Monócitos e neutrófilos de DBa e DBi apresentaram expressão aumentada de NF-B-p65 no estado basal e após estímulo com PMA, TLR-3 e -7. CMSP de pacientes sépticos produziram menos IL10, IL23, TNFα e IFN do que CS, DBa e DBi, sob estímulo com os ligantes de TLR e patógenos. Neutrófilos e CMSP de DBa, DBi e CS produziram mais O2ꜙ e H2O2- quando expostos aos plasmas de DBa e DBi, comparados à exposição ao plasma de CS. Neutrófilos e CMSP de sépticos apresentaram expressão gênica aumentada de GP-91, p40 e p67 no estado basal comparados aos outros três grupos, sendo o mesmo verdadeiro para p22 em neutrófilos. A expressão proteica das cinco subunidades da NADPH-oxidase encontrou-se aumentada em neutrófilos e monócitos de CS, DBi e DBa após estímulo com plasma de DBi ou DBa comparado ao estímulo com plasma de CS. Houve maior produção de NETs em condições basais nos grupos de pacientes com DBa e DBi, comparados aos CS. Da mesma forma, os neutrófilos de DBa e DBi produziram mais NETs do que CS quando submetidos ao estímulo com plasma humano de controles, de DBi e de DBa, porém esse fenômeno foi mais evidente sob estímulo com plasma DBa. Os pacientes com DB apresentaram níveis plasmáticos aumentados de HMGB1 comparados aos CS, independentemente do grau de atividade da doença. Das 35 citocinas cujas concentrações plasmáticas se mostraram elevadas em algum dos grupos de pacientes com DB, destacou-se o CD40 ligante solúvel (sCD40L), com aumento marcante e uniforme em ambos os grupos de pacientes com DB comparados aos CS. Conclusões: Os fagócitos na DB não se mostraram ativados na maior parte de suas funções imunitárias em condições basais, apesar de a formação de NETs e a via do NF-B estarem constitutivamente estimuladas na DB, com aumento adicional após estímulos. A baixa variação na ativação de fagócitos mediante liberação de CD62L pode ser secundária à exaustão da via do NF-B. Como esta é uma condição marcada por manifestações mucocutâneas, células epiteliais podem ser o foco do estímulo inflamatório da doença, liberando fatores solúveis possivelmente carreados pelo plasma, os quais estimulam os fagócitos a distância. Plasma de pacientes com DB foi capaz de estimular a produção de derivados reativos do oxigênio e de NETs, independentemente do estado de atividade da doença, porém de forma mais marcante nos pacientes ativos, o que sugere a presença de algum fator ainda indefinido carreado pelo soro. Similarmente aos nossos resultados acerca do metabolismo oxidativo de fagócitos, estudos demonstraram alterações funcionais em neutrófilos normais induzidas pela exposição ao soro de pacientes com DB. O sCD40L, o qual se mostrou marcantemente aumentado no plasma de pacientes com DBi e DBa na nossa casuística, já foi associado por estudos prévios ao estímulo do metabolismo oxidativo de neutrófilos via NF-B e, portanto, pode estar associado a essas alterações fagocitárias na DB. Estudos adicionais para a identificação de vias metabólicas e fatores solúveis associados à ativação fagocitária são necessários na DB.