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    Análise comparativa entre aspectos microbiológicos de isolados clínicos de candida auris pertencentes a grupos filogenéticos distintos
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-09-27) Kemmerich, Karoline Kristina [UNIFESP]; Almeida Júnior, João Nóbrega [UNIFESP]; Ribeiro, Felipe de Camargo [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3637343622706431; http://lattes.cnpq.br/6338849954541656; http://lattes.cnpq.br/1893422261928586
    Introdução: A levedura do gênero Candida, Candida auris, ganhou notoriedade da comunidade médica e cientifica desde sua primeira descrição em 2009 na cidade de Tóquio, Japão. A espécie possui características biológicas que favorecem sua permanência no ambiente hospitalar, podendo ser encontrada em monitores, cama, termômetro entre outros dispositivos médicos por pelo menos 14 dias. Já quando isolada em pacientes, é encontrada tanto em canal auditivo quanto em urina, sangue, pele e ponta de cateter. São descritas diferentes variedades genotípicas de C. auris que podem estar relacionadas a diferentes comportamentos biológicos. Objetivo: Comparar o comportamento microbiológico de cepas de Candida auris pertencentes a diferentes variedades genéticas armazenadas no Banco de Leveduras do Laboratorio Especial de Micologia Médica da UNIFESP. Métodos: Foram incluídas no estudo 19 cepas de Candida auris pertencentes aos clados genéticos I, II, IV, e V. Foram submetidas a teste de sensibilidade aos antifúngicos, posteriormente à análise de adesão e produção de biofilme por XTT e cristal violeta, e por fim realizou-se curva de sobrevida em modelo in vivo Caenorhabidits elegans para avaliação da virulência. Resultados: Evidenciou-se maior resistência de C. auris para fluconazol. O método EUCAST apresentou maiores concentrações inibitórias mínimas para anfotericina B em comparação ao CLSI. As cepas do clavo IV apresentaram biofilmes com maior taxa metabólica e biomassa em comparação a outros clados. A avaliação in vivo pelo modelo invertebrado Caenorhabidits elegans demonstrou morte de 100% no quarto dia para todos isolados estudados. Conclusões: C. auris apresenta potencial de resistência a diferentes antifúngicos, e existem diferenças entre os resultados quantitativos produzidos pelos métodos CLSI e EUCAST. Entre as cepas avaliadas, as cepas do clado IV podem produzir biofilmes com possível maior potencial de persistência no ambiente. A avaliação da virulência das cepas de C. auris utilizando o modelo de invertebrados C. elegans apresentou resultados que não permitem distinguir diferenças intra-específicas.
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    Análise das propriedades antimicrobianas dos derivados do peptídeo multifuncional Quiotorfina na formação de biofilme
    (Universidade Federal de São Paulo, 2021-02-25) Simões, Fernanda da Silva Seiffert [UNIFESP]; Conceição, Katia [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5360223612968931; http://lattes.cnpq.br/8273242260043933
    A quiotorfina (KTP, L-tirosil-L-arginina) é um neuropeptídeo analgésico endógeno isolado pela primeira vez do cérebro bovino em 1979. Estudos anteriores indicam que a Quiotorfina pode ser considerado um peptídeo multifuncional possuindo principalmente atividades antinociceptiva, neuromodulatória, anti-inflamatória e antimicrobiana. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são uma forma alternativa de combater a alta taxa de resistência de bactérias a antibióticos convencionais. No presente trabalho, três derivados de KTP (Indol-KTP-NH2, GABA-KTP-NH2 e Bu-KTP-NH2) foram selecionados e testados contra as células planctônicas de bactérias gram-positivas (Streptoococcus pneumoniae e Staphylococcus aureus) e gram-negativas (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa). Também foi avaliada a eficiência dos derivados de KTP na inibição da formação de biofilme de microrganismos selecionados. Além dos testes antimicrobianos, foram realizados testes de toxicidade dos derivados contra glóbulos vermelhos, fibroblastos embrionários de camundongos, células tumorais B16-F10-Nex2 e no organismo modelo Galleria mellonella. Os três derivados analisados foram eficazes na inibição do crescimento de E. coli na forma planctônica, sendo que os derivados Indol-KTP-NH2 e GABA-KTP-NH2, apresentaram também atividade significativa no teste de inibição de biofilme E. coli e S. pneumoniae. Todos os derivados apresentaram baixa atividade citotóxica e hemolítica. Os testes de infecção in vivo corroboraram a eficácia do derivado GABA-KTP-NH2 para inibição da infecção causada por E. coli. Esses resultados sugerem que dentre os derivados testados, o mais eficaz, GABA-KTP-NH2, além de sua ação analgésica, pode atuar como um eficaz agente antimicrobiano e, portanto, pode ser considerado um derivado promissor para aplicação terapêutica.
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    Aspectos microbiológicos e moleculares de isolados clínicos pertencentes ao complexo Candida haemulonii
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-07-25) Lima, Soraia Lopes [UNIFESP]; Colombo, Arnaldo Lopes [UNIFESP]; Francisco, Elaine Cristina [UNIFESP]; Melo, Analy Salles de Azevedo [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6620829106814744; http://lattes.cnpq.br/8922840487452492; http://lattes.cnpq.br/4512261018429681; http://lattes.cnpq.br/6572863047648284
    O complexo de espécies Candida haemulonii compreende leveduras patogênicas oportunistas emergentes, representadas por C. haemulonii sensu stricto, C. haemulonii var. vulnera, C. duobushaemulonii, C. vulturna e C. khanbhai. Este complexo de espécies é capaz de causar infecções superficiais e profundas, incluindo candidemia, especialmente em neonatos, pacientes com câncer e/ou diabetes mellitus, bem comopacientes críticos expostos a procedimentos médicos invasivos e antibióticos, e são intimamente relacionadas as espécies C. pseudohaemulonii e C. auris. Isolados clínicos desse táxon têm sido descritos como patógenos multidroga-resistentes (MDR), exibindo elevados valores de concentração inibitória mínima (CIM) aos azólicos e anfotericina B. Atualmente, os métodos fenotípicos comerciais amplamente utilizados na rotina clínicolaboratorial, não permitem a identificação acurada destes agentes, dificultando sua caracterização epidemiológica e vigilância contínua em quadros de IFIs. Além disso, dada a atual instabilidade taxonômica em que as espécies do compl. C. haemulonii são encontradas, é relevante realizar investigações moleculares e biológicas para a classificação deste táxon. Artigo 1: Considerando a falta de dados clínicos e epidemiológicos em relação às infecções causadas pelas espécies do compl. C. haemulonii, o objetivo deste estudo foi investigar tendências históricas na prevalência de leveduras multirresistentes do complexo armazenadas em uma coleção leveduras obtidas durante 11 anos, incluindo amostras coletadas de pacientes em 12 centros médicos e seu perfil de susceptibilidade in vitro. Os isolados foram identificados a partir do sequenciamento da região ITS do DNA ribossomal. Os testes de susceptibilidade aos antifúngicos para anfotericina B, voriconazol, fluconazol, anidulafungina e 5- fluorocitosina foram realizados de acordo com o documento CLSI M27A3. Das 3799 leveduras avaliadas, 49 isolados (1,3%) foram identificados como C. haemulonii ss (n= 21; 43%), seguido por C. haemulonii var. vulnera (n= 15; 30,5%), e C. duobushaemulonii (n= 13; 26,5%). A maior parte destes isolados foram recuperados de infecções invasivas (n= 38; 77,5%). A prevalência de espécies do complexo C. haemulonii aumentou de 0,9% no primeiro período para 1,7% no segundo período de análise [P1 (2008-2013): n=18 de 1931 isolados vs. P2 (2014-2019): n= 31 de 1868 isolados; p= 0,047]. Todos os isolados apresentaram altos valores de CIM para anfotericina B e fluconazol, permanecendo susceptíveis a 5-fluorocitosina e anidulafungina. Artigo 2: O objetivo deste estudo foi avaliar a heterogeneidade molecular e biológica do complexo C. haemulonii e seu potencial impacto na taxonomia de suas espécies. Foram selecionados 75 isolados clínicos e cepas referência. A caraterização molecular foi realizada por sequenciamento das regiões ITS e D1/D2 do DNA ribossomal e AFLP-fingerprinting. Já a caracterização biológica contou com a avaliação da capacidade de formação de biofilme e testes de susceptibilidade in vitro para 4 classes de antifúngicos. Na análise da região D1/D2 do DNAr, os isolados de C. haemulonii ss (n=34) e C. haemulonii var. vulnera (n=17) apresentaram 100% de similaridade sendo agrupados no mesmo cluster. Por outro lado, agrupamentos da região ITS do DNAr e do AFLP mostraram elevada heterogeneidade entre os isolados de C. haemulonii ss e C. haemulonii var. vulnera, sugerindo a presença de outras variedades associadas à espécie SS. Não foi caracterizada diversidade intraespecífica entre os 18 isolados de C. duobushaemulonii testados, que apresentaram maior similaridade genética com C. pseudohaemulonii (taxas de similaridade: ITS= 93%; D1/D2=97%; ALPF= 95,3% ) do que com C. haemulonii ss (taxas de similaridade:ITS=86%; D1/D2= 90%; AFLP 62.1%). Quanto aos aspectos biológicos avaliados, isolados de C. duobushaemulonii apresentaram menor capacidade de formação de biofilme e maiores valores de MIC para AMB (média geométrica= 3,76 μg/ml; MIC90 16 μg/ml; p= <0,05) em comparação com C. haemulonii ss e C. haemulonii var. vulnera (GM= 1.67 e 1.32 μg/ml; CIM90= 2 e 2 μg/ml, respectivamente). Não houve diferenças estatísticas no perfil de susceptibilidade in vitro entre C. haemulonii ss e C. haemulonii var. vulnera (p= >0,05).
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    Avaliação antimicrobiana em superfícies de liga de Ti-6Al-4V texturizadas e tratadas termoquimicamente com laser
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-02-07) Santa Maria, Gabrielle Garcia [UNIFESP]; Conceição, Katia da [UNIFESP]; Oliveira, Aline Capella de [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1801648349786155; http://lattes.cnpq.br/5360223612968931; http://lattes.cnpq.br/4446675840643425
    Biofilmes são comunidades de microrganismos em rede dentro de uma matriz de exopolissacarídeos e a associação dos microrganismos em biofilmes constitui uma forma de proteção ao seu desenvolvimento. Biofilmes estão envolvidos em doenças, como otite, fibrose e, principalmente, infecções em implantes ortodônticos e ortopédicos, que dependendo do grau de contaminação pode levar a uma cirurgia de correção. Dessa forma, encontrar tratamentos que possam inibir o crescimento de biofilme é indispensável e se faz necessário para a diminuição de infecções em implantes, consequentemente diminuição de cirurgias de correção. Com isso, empregou-se o tratamento a laser de CO2 com gás Nitrogênio em liga de titânio, para mudança composicional e morfológica da superfície de Ti-6Al-4V diminuindo assim o crescimento de biofilme no metal. Para isso, foi utilizado parâmetros de processos fixos, com potência de 100W e velocidade de varredura de 30mm/s e com 0,16 mm de diâmetro focal. Trilhas foram formadas a partir da varredura do feixe de laser de CO2, sobre a superfície metálica, variando o espaçamento entre trilhas de 0% (sem espaçamento) (N2_0%) e 60% de sobreposição entre trilhas (N2_60%), seguido de crescimento de Candida albicans para observar a formação de biofilme nas amostras controle e amostras tratadas, a escolha de tal microrganismo se deu por seu grande envolvimento em infecções tanto em ambientes hospitalares, como em cateteres, como em implantes, principalmente implantes metálicos. Após o crescimento do microrganismo, foi utilizado a avaliação por análise de biomassa, utilizando o método de cristal violeta (MORI et al., 2009) e contagem de unidades formadoras de colônias (CFU). Resultados nas superfícies tratadas, quando comparadas com a controle, mostram a formação de nitretos de titânio, formados na superfície tratada, também foi observado a diminuição do crescimento de C.albicans, com redução de aproximadamente 75% para N2_0% e 40% para N2_60%. Dessa forma, conclui-se que a texturização a laser, associada à modificação composicional da superfície na liga de titânio, diminuiu a formação de biofilme contínuo sobre a superfície, reduzindo também a viabilidade celular na região, como comprovado pela análise de biomassa empregada.
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    Avaliação das propriedades físico-químicas de ligas à base de cobre com potencial atividade microbicida
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-05-29) Guerini, Guilherme Gonçalves [UNIFESP]; Silva, Ricardo Alexandre Galdino da [UNIFESP]; Vasoncellos, Suzan Pantaroto de [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4254240006926714; http://lattes.cnpq.br/6350523822780669; http://lattes.cnpq.br/0006269777203944
    O cobre (Cu) e suas ligas têm atraído a atenção de pesquisadores nos últimos anos devido à sua capacidade microbicida contra diversos microrganismos, possuindo várias aplicações na medicina e como forma de prevenir a propagação de doenças em ambientes de alta circulação humana (hospitais e transporte público). Porém, a utilização do cobre puro é inviável devido aos processos de oxidação e corrosão em diferentes meios que afetam a estética e a vida útil do material. Assim, no intuito de melhorar o comportamento de corrosão sem prejudicar a atividade microbicida, neste estudo foram avaliadas inicialmente seis ligas de CuZnNi e o latão 70/30 para entender suas características físico-químicas em diferentes eletrólitos e sua atividade microbiológica contra bactérias e leveduras de interesse clínico. Para isto, foram realizados testes físico-químicos e eletroquímicos para caracterização das amostras em solução de NaCl 0,5 ϻ e de suor artificial para mimetizar condições desafiadoras e aquelas encontradas no cotidiano. Já para os testes microbiológicos foram realizados ensaios com bactérias e leveduras para avaliar sua capacidade microbicida e de evitar a formação de biofilmes. Tais ensaios conduziram o trabalho à seleção de uma liga que apresentasse a melhor capacidade de resistência à corrosão para a mesma atividade microbicida observada nas demais ligas. Os dados obtidos por difratometria de raios X confirmaram a presença de duas fases ricas em cobre, ambas provenientes do processo de solidificação do material. Além disso, os resultados mostraram que a adição de níquel promoveu um refinamento da microestrutura das ligas. As medidas de potencial de circuito aberto mostraram que o aumento do teor de Ni nas ligas tornam os valores de potenciais mais positivos, sugerindo que os materiais tornam se mais nobres. Os resultados indicaram também que a liga Cu68,85Zn26,36Ni4,69, denominada A5, apresentou o melhor comportamento em relação a resistência à corrosão para um mesmo comportamento microbicida frente as outras ligas estudadas. Assim, a liga Cu68,85Zn26,36Ni4,69 foi selecionada para dar continuidade aos testes com solução de NaCl 0,5 ϻ e suor artificial, em comparação com o cobre puro. Quanto à voltametria cíclica, em suor artificial, observou-se uma inversão na intensidade dos picos de oxidação referentes à formação dos íons Cu+ e Cu2+. A liga apresentou menor potencial de corrosão e maior taxa de corrosão em suor artificial. A espectroscopia por impedância eletroquímica demonstrou uma maior resistência do cobre em ambos os meios e a liga A5 mostrou uma menor resistência à transferência de carga (Rct) para o suor artificial. A espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado mostrou que em suor artificial a liga A5 apresentou maior liberação de íons nos primeiros minutos de imersão. Por fim, pode-se sugerir que as espécies Cu2O, Cu(OH)2, CuCl2, ZnCl2 e Zn(OH)2 são os produtos de corrosão majoritários para os meios analisados. Quanto a atividade microbiológica, a liga A5 foi capaz de inativar os microrganismos testados em menos de 30 min de contato. Além disso, ela apresentou uma capacidade pronunciada de morte celular com uma melhor dispersão de biofilme quando comparada com o aço inoxidável 304 (superfície inerte). Assim, o presente estudo indica que a liga Cu68,85Zn26,36Ni4,69 reuniu as melhores características para se tornar uma alternativa para futuras aplicações nos setores médicos e sanitários.
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    Avaliação de ligas de cobre como agentes desestabilizantes de biofilme bacteriano: uma perspectiva de sua aplicação contra a poluição ambiental
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-01-04) Almeida, Juliana Bertolino Sena de [UNIFESP]; Vasconcellos, Suzan Pantaroto de [UNIFESP]; Vital, Vitor Gonçalves; http://lattes.cnpq.br/4254240006926714; http://lattes.cnpq.br/9149794543954265
    O cobre (Cu) é um elemento conhecido por sua importância, como, micronutriente para o bom funcionamento de metabolismo de seres vivos, outra característica desse elemento é a presença de atividade microbicida, característica essa que já é conhecida e empregada a milhares de anos. Essa utilização se dá por esse elemento apresentar taxas de toxicidade a microrganismos quando em exposição prolongada e altas concentrações, causando interferências estruturais e metabólicas nesses microrganismos. Atualmente o elemento já vem sendo utilizado como parte da composição de alguns materiais como tintas, fibras de roupas, com o intuito de trazer uma maior proteção contra microrganismos patogênicos. Ao longo dos últimos anos, é observado um aumento do fator de virulência de bactérias, tornando os antibióticos e soluções sanitizantes menos eficientes no combate a esses microrganismos, e com isso a necessidade de buscar novos meios de maior eficiência para essa eliminação. Nesse estudo, a partir das análises de absorbância dos cupons de Cu inoculados com a bactéria Pseudomonas aeruginosa foi identificado que cupons de Cu inoculados com a bactéria apresentaram atividade inibidora da formação de biofilme após 14 dias em contato com os cupons, assim como, a solução de Acetato de Cobre II Cu (CH3COO)2, apresentou um potencial parcial de atividade inibidora de crescimento de biofilme após 14 dias em contato com os cupons. Após a realização das análises e identificação do seu real potencial de inibição do crescimento de biofilme da bactéria Pseudomonas aeruginosa em sua superfície, foram trazidas perspectivas da utilização desse material e solução como agente biocida para a não formação e eliminação de biofilme em tubulações industriais. Como forma de evitar processos de bioincrustação, os quais acarretam em vazamentos e rompimento de dutos, trazendo prejuízos econômicos e ambientais como a contaminação de solo, água, populações humanas, assim como da fauna e flora.
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    Caracterização dos mecanismos de resistência à polimixina B em isolados clínicos de A. baumannii após a exposição in vitro à mesma e sua implicação na adesão e produção de biofilme
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-01-08) Carneiro, Talita Barone [UNIFESP]; Gales, Ana Cristina [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8402272715765172; http://lattes.cnpq.br/1278660165683119; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Acinetobacter baumannii is one of the most common pathogens causing serious infections in hospitalized patients. These microorganisms have high ability to adapt to the hospital environmental, and acquire resistance to almost all available antimicrobials. The polymyxins are the last therapeutic options for treatment of these infections. We evaluated the mechanism of resistance and biofilm production among A. baumannii clinical isolates after in vitro exposition to polymyxin B, after 10 consecutive days, using increased concentrations of polymyxin B sulfate. pmrCAB and lpxACD genes, related with polymyxins resistance and ompA, csuE and pgaC genes, involved with the biofilm production were analyzed by nucleotide sequencing and qRT-PCR. Potential Zeta of bacterials membrane and biofilm quantification in microtiter plates were also evaluated. The exposition of A. baumannii clinical isolates to polymyxin B resulted in polymyxin B resistance in all tested isolates, and led to the reduction of MICs to other tested antimicrobials, except for minociclin. Five isolates had mutations in the pmrB and 3 isolates in the lpxC genes, after polymyxin B exposition. One isolate had pmrB and lpxC mutations concomitantly. The relative transcription rates were reduced for pmrB, while they were increased for lpxC after most isolates after polymyxin B exposition. In contrast, no significant differences in the membrane zeta potencial and biofilm quantification were noticed. All isolates had the ompA and most isolates (12) had csuE transcriptional levels increased. In addition, 11 isolates had elevation in the pgaC transcription rates after polymyxin B exposition. Our study illustrates the complexity of mechanisms leading to polymyxin resistance because in most isolates the mechanism remained undetermined. Although changes in the outer membrane permeability might have occurred after polymyxin B exposure, they were not significant enough to reduce the negative electric charge of the outer membrane or biofilm production by A. baumannii resistant to polymyxin B.
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    Caracterização fenotípica e molecular de amostras de Staphylococcus spp. isoladas de fluído de sonicação de implantes ortopédicos infectados
    (Universidade Federal de São Paulo, 2021-05) Santos, Ingrid Nayara Marcelino [UNIFESP]; Pignatari, Antonio Carlos Campos [UNIFESP]; Salles, Mauro José Costa [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3119933864520484; http://lattes.cnpq.br/9461346610553865; http://lattes.cnpq.br/7196518766323325
    As infecções associadas a dispositivos ortopédicos (ODRIs) são causadas principalmente por Staphylococcus spp. formadores de biofilme, incluindo Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase negativo (CoNS). Nosso objetivo foi caracterizar a capacidade de formação de biofilme, virulência e o perfil de sensibilidade em isolados de Staphylococcus spp recuperados de fluido de sonicação de ODRIs, por métodos fenotípicos e moleculares. Foram coletados e analisados dados clínicos e microbiológicos de 32 pacientes, com ODRIs, entre os quais os implantes foram retirados e submetidos a sonicação. Os micro-organismos foram identificados pela técnica de dessorção em vôo de espectrometria de massa por ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). O teste de susceptibilidade antimicrobiana foi realizado por disco difusão e a técnica de microdiluição em caldo foram utilizadas para avaliar a concentração inibitória mínima (CIM) para a vancomicina. Os resultados foram interpretados de acordo com o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) e Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BrCAST) (2020). A detecção do gene, mecA e icaAB foi realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR). Foi realizado o ensao qualitativo para avaliação da produção de biofilme em superfícies abióticas. No estudo realizada comparações de resultados utilizado o cálculo estatístico para o coeficiente de Kappa. O sequenciamento do genoma completo (SGC) foi feito usando a plataforma Illumina MiSeq. No geral, 32 Staphylococcus spp. foram isolados, S. aureus em 50% (16/32), S. epidermidis em 25% (8/32) e S. haemolyticus em 16% (6/32). Todos os isolados de S. aureus foram resistentes a meticilina e mecA positivos. Entre os SCoN a resistência foi observada foi de 56,2%. Na avaliação qualitativa da capacidade de formação de biofilme dos isolados em superfícies abióticas, 75% (N = 24/32) dos isolados foram fortes produtores de biofilme. A concordância entre detecção do gene icaAB e formação de biofilme pelo coeficiente de Kappa foi fraca. A análise de sequenciamento mostrou que entre 3 cepas de S. aureus, duas eram ST 5 e uma ST105. Os Sccmec encontrados foram tipo I, II e V. Os três isolados pertenciam ao CC5. Os genes de resistência e virulência de S. aureus foram detectados incluindo múltiplos genes codificadores de AMEs, mecA, blaZ, fnbA, sdrC, sdrD, sdrE, ebp. Entre os SCoN, notou-se uma grande variabilidade quando a presença de genes de que expressam aderência (MSCRAMMs), sendo os genes mais frequentemente identificados foram, atl, ebp e ebh A realização do SGC nestes isolados forneceu informações importantes e mais completas com relação a presença de múltiplos genes de resistência e de virulência, incluindo os genes associados a formação de biofilme. Este estudo oferece ferramentas para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na patogênese destas infecções.
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    Caracterização molecular da formação de biofilme por Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) O119
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2019-02-28) Flores, Maricelia Navarro Pinheiro [UNIFESP]; Scaletsky, Isabel Cristina Affonso [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8411282118391609; http://lattes.cnpq.br/8538548568073264; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    EPEC can be categorized into two subgroups, typical (tEPEC) and atypical (aEPEC), based on the presence or absence of the EPEC adherence factor plasmid (pEAF), respectively. EPEC colonizes the proximal small intestine, where it adheres to epithelial cells forming microcolonies. Microcolony formation is one of the initial steps in biofilm development, but, very little is known regarding biofilm formation by EPEC strains. Our laboratory investigated the ability of biofilm formation in a collection of 223 EPEC strains (70 typical and 153 atypical) belonged to EPEC and non-EPEC serogroups. Biofilm formation occurred in 11/ tEPEC and 37 aEPEC strains from different serotypes. Typical EPEC formed biofilm on a polystyrene plate at 37C, whereas aEPEC strains formed at 26C in LB, or LBNS. The gene sequences related to type 1 fimbriae, curli, flagellin, antigen 43, and the autotransporter proteins of enterohemorrhagic E. coli EhaA, EhaB (ehaBa and ehaBb) and Cah were identified in most of the typical and atypical biofilm-producing strains. The objetive of this study was to continue the studies of our laboratory, identifying the genetic determinant involved in the biofilm formation of one tEPEC strain. We began the study by selecting the tEPEC strain between the group of the strains previously characterized as biofilm forming. Biofilm formation quantification results showed that three strains presented strong biofilm and seven strains presented moderate biofilm at 37ºC in LBNS medium. Among the 3 strains, T29 (O119: H6) strain was selected for presenting a robust biofilm on abiotic surface and a dense pellicle at the air-liquid interface. The T29 strain (O119: H6) was mutagenized with the transposon mini-Tn10, and four mutants (M6, M21, M160 and M175) were identified that lost the ability to form biofilm on polystyrene surface and pellicle at the liquid-air interface. The DNA flanked by the transposon insert was cloned into the plasmid vector pUC19, and the clones obtained were sequenced. BLASTN analysis of the 529 bp and 322 bp sequences obtained from the sequencing of clones M6.1 and M21.1, respectively, revealed homology with the enzyme aspartate ammonia lyase and fimD gene related to fimbriae type 1. Studies are in progress with mutants M160 and M175.
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    Caracterização molecular, avaliação do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e formação de biofilme de isolados clínicos pertencentes ao complexo Candida haemulonii e Candida auris
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-06-29) Lima, Soraia Lopes [UNIFESP]; Melo, Analy Salles de Azevedo [UNIFESP]; Padovan, Ana Carolina Barbosa; http://lattes.cnpq.br/7106567615656883; s http://lattes.cnpq.br/8922840487452492; http://lattes.cnpq.br/6572863047648284; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The Candida haemulonii complex (C. haemulonii, C. haemulonii var. vulnera and C. duobushaemulonii) and the phylogenetically related species (C. auris and C. pseudohaemulonii) are agents of superficial and invasive mycoses, responsible for high rates of morbidity and mortality. The phenotypic methods are unable to correctly identify closely related species, such as that included in the C. haemulonii complex. It is essential to use molecular techniques for identification, and sequencing the ITS region of the ribosomal DNA is considered the gold standard method for Candida species identification. As these microorganisms can be found in hospital environments and have shown low susceptibility to antifungal agents, it is essential that more studies are performed to evaluate their biological characteristics. Objectives: (i) To identify clinical isolates stored at the Culture Collection of LEMI, identified as C. haemulonii (sensu lato) and C. auris by sequencing the ITS region of rDNA generating high quality sequences; (ii) To evaluate in vitro susceptibility profile of these isolates with 5 antifungal agents; (iii) To evaluate biofilm formation of C. haemulonii (sensu lato) isolates and related species. Material and methods: Sixty-six clinical isolates from different sites were selected from several medical centers from four Latin American countries from 2008 to 2016. For the molecular identification, ITS sequencing was performed and the sequences obtained were compared to those deposited in NCBI genomic database. Susceptibility tests with the antifungals fluconazole (FLC), voriconazole (VRC), anidulafungin (ANI), 5-fluorocytosine (5-FC) and amphotericin-B (AMB) were performed according to CLSI document M27-A3. For the biofilm assays, 96-well plates were used and biofilm quantification was performed by using violet crystal staining. Results: Among the 66 isolates studied, 37 were identified as C. auris, 11 as C. haemulonii var. vulnera, 9 as C. haemulonii (sensu stricto) and 9 as C. duobushaemuonii. No C. pseudohaemulonii isolates were found. Inter-specific variability of antifungal susceptibility was observed among four agents tested. The 4 species identified were resistant to AMB and FLC. Regarding VRC, lower MICs were obtained for the majority of C. haemulonii (sensu lato) isolates. 5-FC and ANI agents showed activity against the isolates tested. Regarding the biofilm formation, C. haemulonii (sensu stricto) and C. haemulonii var. vulnera were the species that showed higher intra-specific variability. The species that presented the highest and the lowest biofilm formation were C. auris and C. duobushaemulonii, respectively. Conclusions: The sequencing of ITS region allowed accurate identification of all isolates and generated high quality sequences. C. haemulonii complex and C. auris were resistant to AMB and FLC, but the majority of the isolates were susceptible to ANI and 5-FC. All species studied were able to form biofilm, especially C. auris, which presented the highest capability to produce biofilm.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Descoberta de antimicrobianos de amplo espectro contra diferentes formas de colonização de Staphylococcus epidermidis
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-11-14) Morgado, Priscylla Guimarães Migueres [UNIFESP]; Moraes, Carolina Borsoi [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/2856012942943418
    Apesar de presente na microbiota humana, a espécie Staphylococcus epidermidis é considerada um patógeno oportunista frequentemente associado às infecções crônicas e de difícil tratamento. A crescente falha terapêutica tem sido associada tanto à resistência, com mecanismos envolvendo o genoma bacteriano, quanto a variações fenotípicas de diferentes formas de colonização – biofilmes, fase planctônica e bactérias intracelulares. As diferenças celulares e moleculares desses fenótipos ainda são pouco entendidas e podem estar relacionados à falha no tratamento quimioterápico de infecções por S. epidermidis. Diante disso, torna-se necessário descobrir novos fármacos com atividade antibiofilme e nas outras formas de colonização para erradicação dessas infecções. Objetivo: O presente estudo teve como objetivos a descoberta de compostos com atividade antibiofilme e, idealmente, com amplo espectro de atividade contra diferentes fenótipos de S. epidermidis, assim como, o estudo do modo de ação dos compostos mais promissores. Métodos: Foi desenvolvida uma cascata de triagem para priorização de compostos com atividade desejada. Inicialmente, biofilmes de S. epidermidis foram analisados como modelo inicial para descoberta de fármacos. Ensaios de inibição da formação de biofilme e da fase planctônica foram otimizados e validados em diferentes meios de cultura e métodos de análise de metabolismo celular. Foi então realizada uma triagem primária com 2437 compostos (obtidos de fonte comercial ou colaborações acadêmicas) em biofilmes de S. epidermidis. Os resultados foram analisados e confirmados por dois métodos de leitura diferentes. Para identificar atividades já descritas dos compostos comerciais que obtiveram promissora atividade (denominados hits) comerciais, foram avaliados bases de dados com coleções de moléculas criadas e documentadas com sua principal atividade. Os hits com atividade inédita foram analisados em ensaios secundários com outros fenótipos de colonização de S. epidermidis. A citotoxicidade dos hits foi analisada nas linhagens celulares humanas THP-1 e U2OS. Resultados: Após otimização dos ensaios de formação de biofilme em meio BM e validação com o antibiótico linezolida, a triagem confirmatória de atividade avaliou compostos hits em curva concentração-resposta. Do total, 25 hits demonstraram atividade antibiofilme e, destes, oito hits comerciais com atividade farmacológica conhecida apresentaram atividade nunca antes descrita. Sete hits apresentaram atividade antiplanctônica, 13 hits apresentaram atividade de disrupção em biofilmes previamente formados e destes, nove hits apresentaram atividade em todos os fenótipos analisados. A citotoxicidade dos hits indicou que 17 hits apresentam índices de seletividade (IS) satisfatórios (IS ≥ 10) em relação aos biofilmes, considerando ambas as linhagens testadas. Conclusões: Foi possível demonstrar a robustez e confiabilidade do ensaio para diferentes formas de colonização de S. epidermidis, sendo identificados 25 hits com atividade antibiofilme inédita. Nove hits apresentaram amplo espectro de atividade em todos os fenótipos analisados. Futuramente, esses compostos podem tornar-se viáveis alternativas para identificação de novos alvos contra S. epidermidis, além de auxiliar no entendimento dos sistemas de virulência deste patógeno oportunista.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Desenvolvimento de um protótipo para geração de nano e microfibras: rotofiador
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-01-31) Ramos, Suzane Cristina de Lima [UNIFESP]; Soares, Vitória de Oliveira [UNIFESP]; Concha, Viktor Oswaldo Cárdenas [UNIFESP]; Soares, Vitória; http://lattes.cnpq.br/0661599261187131
    Atualmente a geração de fibras em escala micrométrica e nanométrica tem ganhado destaque devido a inúmeras aplicações destes materiais principalmente na área biomédica, por apresentarem alta capacidade mimética, como por exemplo, os scaffolds, estruturas utilizadas na engenharia de tecidos. Dentre as técnicas utilizadas para a geração destas fibras temos: fiação, eletrofiação, impressão 3D e rotofiação. A rotofiação é uma técnica simples, de baixo custo e que apresenta maior taxa de produção quando comparada às demais. Sendo assim, este trabalho tem por objetivo a construção de um protótipo, além de explorar os principais aspectos tais como: conceito, tipos de configurações, parâmetros que influenciam a geração das fibras e aplicações. A montagem do protótipo será baseada em conceitos e equipamentos existentes no mercado. O rotofiador apresenta a seguinte configuração: copo oco (deposição da solução polimérica), motor e sistema coletor de fibras. Através deste trabalho espera-se obter um equipamento versátil e de fácil manuseio, permitindo a obtenção de micro ou nanofibras a partir de biopolímero. Cabe ressaltar que não existe este equipamento para compra no mercado e pesquisa realizada para sua construção com fornecedor verificou-se que o preço fica em torno de 15 mil reais. Com isso, através deste estudo verificou-se que é possível a construção de um rotofiador de baixo custo, podendo ficar em torno de 2 mil reais.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo do efeito microbicida da adição de nanopartículas de prata em membranas de um copolímero de poliéter e poliamida comercial (PEBAX-2533)
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-06-05) Barros, Larissa Cardoso de [UNIFESP]; Camilo, Fernanda Ferraz [UNIFESP]; Silva, Flavia Tavares da; https://bv.fapesp.br/pt/pesquisador/93340/fernanda-ferraz-camilo/; http://lattes.cnpq.br/7155923130289771
    Este trabalho de conclusão de curso teve como objetivo principal a preparação de membranas elastoméricas utilizando o copolímero PEBAX-2533, enriquecido com nanopartículas de prata, com potencial uso em dispositivos médicos, como cateteres e implantes. O PEBAX-2533 é conhecido por suas excelentes propriedades mecânicas e flexibilidade. Nanopartículas de prata, escolhidas por suas eficazes propriedades microbicidas, foram sintetizadas utilizando o método bottom-up, que permite controle preciso sobre o tamanho e a forma das partículas. A síntese foi realizada em 1-butanol, um solvente capaz de dissolver eficientemente tanto o PEBAX-2533 quanto as nanopartículas de prata, garantindo a compatibilidade entre os componentes e a integridade das nanopartículas incorporadas. As membranas resultantes foram caracterizadas para avaliar a distribuição, estabilidade térmica e a integração das nanopartículas de prata na matriz do PEBAX. Os resultados mostraram que as membranas mantêm estabilidade térmica até 210 °C, o que as qualifica para aplicações biomédicas que exigem esterilização a altas temperaturas. Os testes funcionais focaram na capacidade das membranas de dispersar biofilmes de Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria notória por sua resistência a tratamentos e prevalência em infecções hospitalares. Os resultados indicaram que as membranas contendo nanopartículas de prata são capazes de conter a formação de biofilmes. Em particular, a membrana com 1% de massa de nanopartículas de prata e 10 mM de concentração mostrou os melhores resultados, dispersando efetivamente o biofilme e impedindo a proliferação bacteriana.
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    Acesso aberto (Open Access)
    O potencial da luz ultravioleta na descontaminação de biofilme fúngico em lentes de contato gelatinosas
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-05-27) Rosa, Larissa Rigobeli da [UNIFESP]; Cristovam, Priscila Cardoso [UNIFESP]; Santos, Vagner Rogério dos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0921491281575273; http://lattes.cnpq.br/4581855390314828; http://lattes.cnpq.br/9001417028899226
    A utilização de Lentes de Contato, tanto para correção de problemas oculares como para uso estético, pode ocasionar sérios problemas oculares em seus usuários, como ceratites e hipersensibilidade a soluções destinadas a limpeza das lentes. Entre as causas dessas complicações, está o mau uso dos produtos disponíveis no mercado para a limpeza das lentes (que demandam tempo e dedicação para que sua ação germicida seja alcançada), a toxicidade dos reagentes presentes nesses produtos e a formação de biofilme aumentam o risco das complicações oculares decorrente das infecções. A luz ultravioleta (UV) é uma onda eletromagnética que carrega energia, está compreendida entre os espectros de onda do raio-X. Seu potencial germicida é capaz de eliminar microrganismos de superfícies bióticas como células e abióticas como o plástico. O presente estudo tem como objetivo comparar o potencial da luz ultravioleta na descontaminação de lentes de contato gelatinosas em relação a solução de limpeza. Lentes de contato gelatinosas foram contaminadas com cepas conhecidas de Candida albicans e Fusarium solani e posteriormente tratadas de acordo com os grupos (n=5): solução limpeza (SL) ou luz ultravioleta (UVC). Lentes contaminadas sem tratamento foram utilizadas como controle positivo (CT+) e, lentes virgens sem contaminação ou tratamento foram utilizadas como controle negativo (CT-). A formação de biofilme foi avaliada por microscopia óptica e por coloração com Calcofluor White, a viabilidade dos microrganismos foi avaliada pelo método de XTT. Além disso, medidas de diâmetros das lentes de contatos foram obtidas por paquimetria, dioptrias por lensômetro, e análise das propriedades termodinâmicas das LC por análise termogravimétrica. Os resultados demonstraram que o uso isolado da luz Uv ou solução de limpeza não foi 100% eficaz na descontaminação das lentes de contato, porém, a ação germicida da luz Uv sobre o biofilme de Candida albicans e Fusarium solani formado em lentes de contato gelatinosas apresentou ser mais efetiva em comparação a solução de limpeza, sem induzir alteração das propriedades das lentes de contato.