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Title: Papel Da Família Da Heat Shock Protein 70 (Hsp70) Como Alvo Terapêutico Em Mieloma Múltiplo Através De Análises In Vitro E In Vivo
Authors: Colleoni, Gisele Wally Braga [UNIFESP]
Eugenio, Angela Isabel Pereira [UNIFESP]
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Keywords: Multiple Myeloma
Hsp70
Proteotoxic Stress
Ubiquitin Proteasome System
Unfolded Protein Response
Autophagy
Mieloma Múltiplo
Hsp70
Estresse Proteotóxico
Sistema Ubiquitina-Proteasoma
Upr E Autofagia
Issue Date: 7-Mar-2017
Publisher: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Abstract: Introduction: HSP70 has integrative role in protein degradation due to the interaction with many pathways, such as ubiquitin proteasome, unfolded protein response and autophagy. Objectives: To explore the role of HSP70 as a therapeutic target for multiple myeloma (MM) through in vitro and in vivo analyses. Methods: Bioluminescent cell lines RPMI8226-LUC-PURO and U266-LUC-PURO were treated with HSP70 inhibitor (VER155008) and proteasome inhibitor (bortezomib) for evaluation of apoptosis by flow cytometry. HSP70 members, unfolded protein response and autophagy genes were evaluated by qPCR in the same cell lines. Immunodeficient mice were used for subcutaneous xenograft model in two different approaches: RPMI8226-LUC-PURO cells into the right flank to induce a plasmocytoma. When the tumors became palpable mice were randomised to receive bortezomib, VER155008 or bortezomib plus VER155008 or no intervention. Histologic and protein expression analysis were performed. In a second model, each mouse was inoculated at the same moment, with RPMI8226-LUC-PURO cells into the left and U266-LUC-PURO into the righ flank. Mice were randomised into four groups of treatment and received intravenously proteassome and HSP70 inhitors immediately after xenotransplantation of the cell lines. Bioluminescence (BLI) was measured once a day for seven days. Results: RPMI8226- LUC-PURO and U266-LUC-PURO cell lines express HSP70 family genes, XBP-1 and BECLINA-1. Both cell lines treated with bortezomib, VER155008 (50μM and 80μM), isolated or combined, responded with increased expression of HSPA1A/HSPA1B. RPMI8226-LUC-PURO also showed increased expression of HSPA5 and XBP-1 genes after treatment with VER155008 (50μM). RPMI8226-LUC-PURO almost 60% of late apoptosis after treatment with bortezomib (100nM) alone. Treatment with VER155008, isolated or combined with bortezomib, did not add benefit to bortezomib treatment in 128 this cell line. However, U266-LUC-PURO cell line showed over 60% of cell death after treatment with VER155008 (80μM) alone and also with VER155008 (80μM) plus bortezomib, 48 hours after treatmet. In vivo data showed tumor growth reduction by bioluminescence in the group with RPMI8226-LUC-PURO plasmocytoma after treatment with bortezomib, VER155008 or combination of drugs compared to the control group. Nevertheless, the expression of HSP70 proteins, XBP-1s and BECLINA-1 had no statistically significant changes, except for reduction of XBP-1s protein relative expression in to tumors treated with VER155008. For the group of mice that had no prior induction of tumor, treatment with bortezomib, isolated or combined with VER155008 showed inhibition of tumor growth (or incipient growth) assessed by bioluminescence after one week for both cell lines when compared with the control group. Conclusion: Our study shows that the combination of proteasome and HSP70 inhibitors induced cell death in tumor cells in vitro and in vivo (late apoptosis induction and inhibition of tumor growth). Since HSP70 connects multiple signaling pathways that work synergistically to protect tumor cells from death by proteotoxic stress, it can represent a key role to establish a new approach for the treatment of MM (after achievement of the best response or as maintanence therapy) mostly in patients with deletion of 17p (like U266 cell line).
Introdução: HSP70 tem papel integrador na restauração da homeostase proteica devido à interação com múltiplas vias de sinalização, como a via ubiquitina-proteassoma, UPR e autofagia. Objetivos: Explorar o papel da HSP70 como alvo terapêutico em mieloma múltiplo (MM) através de análises in vitro e in vivo. Métodos: As linhagens celulares bioluminescentes RPMI8226-LUC-PURO e U266-LUC-PURO foram tratadas com inibidor de HSP70 (VER155008) e com o inibidor de proteassoma (bortezomibe) para avaliação da apoptose tardia por citometria de fluxo. Os membros da família da HSP70 e os genes relacionados à via UPR e autofagia foram avaliados por qPCR utilizando as mesmas linhagens celulares não tratadas comparadas às linhagens celulares tratadas com os inibidores de proteasoma e de HSP70 (isolados ou combinados). Camundongos imunodeficientes foram utilizados para o modelo de plasmocitoma subcutâneo em duas abordagens diferentes: células RPMI8226-LUC-PURO foram injetadas no flanco direito para induzir a formação de um plasmocitoma. Quando os tumores se tornaram palpáveis, os camundongos foram distribuídos aleatoriamente e tratados com: bortezomibe, VER155008, bortezomibe + VER155008 e grupo controle (sem intervenção). A análise da expressão de proteínas foi realizada a partir de tecido tumoral congelado. Na segunda abordagem, os camundongos foram inoculados com células U266-LUC-PURO e RPMI8226-LUC-PURO e matrigel nos flancos direito e esquerdo e novamente distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de tratamento e tratados com: bortezomibe, VER155008, bortezomibe + VER155008, que foram infundidos logo após a inoculação das células no flanco e grupo controle. A bioluminescência foi medida uma vez por dia durante sete dias. Resultados: As linhagens celulares RPMI8226-LUC-PURO e U266-LUC-PURO expressam os genes da família HSP70, o gene XBP-1 e o gene BECLIN-1. Ambas as linhagens celulares tratadas com bortezomibe ou VER155008 (50μM e 80μM), isolados ou em combinação, responderam com aumento da expressão de HSPA1A/HSPA1B. A linhagem celular RPMI8226-LUC-PURO também mostrou expressão aumentada dos genes HSPA5 e XBP-1 após tratamento com VER155008 (50μM). Além disso, o tratamento com bortezomibe isolado (100nM) mostrou 65% de células em apoptose tardia. O tratamento com VER155008, isolado ou combinado com bortezomibe, não adicionou benefício ao tratamento para esta linhagem celular. No entanto, a linhagem celular U266-LUC-PURO mostrou mais de 60% de morte celular após tratamento com VER155008 (80μM), isolado ou combinado com bortezomibe, após 48 e 72 horas de incubação. Os dados in vivo mostraram uma redução do crescimento tumoral por bioluminescência no grupo de camundongos com plasmocitoma derivado de células RPMI8226-LUC-PURO após tratamento com bortezomibe, VER155008 ou combinação em comparação com o grupo controle. No entanto, as proteínas HSP70, XBP-1s e Beclin-1 não apresentaram alterações estatisticamente significantes quando extratos proteicos foram analisados por Western Blotting, com exceção da redução da expressão da proteína XBP-1s nos tumores de camundongos tratados com VER155008. Para o grupo de camundongos que não foram submetidos à indução prévia de tumor, o tratamento com bortezomibe, isolado ou combinado com VER155008 mostrou inibição do crescimento tumoral (ou crescimento incipiente) avaliado por bioluminescência, após uma semana para ambas as linhagens celulares quando comparado com o grupo controle. Conclusão: Nosso estudo demostrou que a combinação dos inbidores de proteassoma e de HSP70 induz morte celular em células de MM in vitro e in vivo (indução de apoptose tardia e inibição do crescimento tumoral). Uma vez que HSP70 conecta várias vias de sinalização que trabalham sinergicamente para proteger as células tumorais da morte celular por estresse proteotóxico, pode representar um papel fundamental para estabelecer uma nova abordagem para o tratamento de MM (após obtenção da melhor resposta ou como terapia de manutenção) principalmente em pacientes com deleção de 17p (como a linhagem U266).
URI: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50394
Other Identifiers: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5562918
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