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Title: Avaliação do efeito da riboflavina e luz ultravioleta sobre os ceratócitos e luz ultravioleta sobre os ceratócitos in vitro
Authors: Sato, Elcio Hideo Sato [UNIFESP]
Covre, Joyce Luciana [UNIFESP]
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Keywords: córnea
estroma da córnea
ceratócitos
córnea
estroma da córnea
ceratócitos
Issue Date: 31-Jul-2013
Publisher: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Citation: COVRE, Joyce Luciana. Avaliação do efeito da riboflavina e luz ultravioleta sobre os ceratócitos e luz ultravioleta sobre os ceratócitos in vitro. 2013. 32 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2013.
Abstract: Purpose: Obtain culture of human keratocytes quiescent and evaluate the riboflavin and ultraviolet light effect on human keratocytes cultivated in vitro. Methods: Keratocytes were obtained from human corneal rims remnants of tissue previously used in corneal transplants at the Department of Ophthalmology of UNIFESP/EPM, and cultured in DMEM/F12 medium with FBS until confluence. The cell cultures were characterized by immunofluorescence with antibodies to K3 (epithelial marker), Thy 1(fibroblast marker), ?-SMA (myofibroblast), Lumican (keratocyte markers) Immunoflufluorescence was also perfomed after treatment. The corneal stroma cells were covered with collagen (200?L and 500 ?L) and 0.1% of riboflavin and were exposed to ultraviolet light (UV) for 30 minutes. After 24 hours, cytotoxicity was determined by MTT assay and cell viability was performed with dye Hoechst 33342/Propidium Iodide. Results: Cell cultures reached confluence in about 20 days. Immunofluorescence pointed higher expression for keratocyte markers (Lumican) and low expression for epithelial (K3), fibroblast (Thy 1) and myofibroblast (alpha-SMA) markers. After crosslinking, MTT analysis showed that cells had low rates of toxicity and dyed cells with Hoechst 33342/Propidium Iodide had low rates of apoptosis and necrosis respectively in all groups that contained collagen. Conclusion: Keratocytes cultures were successfully obtained and characterized by immunofluorescence to Lumican. MTT assay and staining with Hoechst 33342 and propidium iodide showed a higher rate of cell death in the groups not containing collagen, proving that protects cells against the effects of UVA light.
Objetivo: Obter cultura de ceratócitos humanos quiescentes e avaliar o efeito da aplicação da luz UVA e riboflavina sobre ceratócitos da córnea humana in vitro. Methodos: Os ceratócitos foram obtidos a partir das rimas corneoesclerais remanescentes da trepanação de córneas previamente utilizadas em cirurgias de transplante de córnea no Centro Cirúrgico do Departamento de Oftalmologia da EPM/UNIFESP, e cultivadas em meio DMEM/F12 com 2% de FBS até atingir confluência. As culturas de células foram caracterizadas por imunofluorescência com os anticorpos K3 (marcador de células epiteliais), Thy-1 (marcador de fibroblasto) SMA (marcador de miofibroblasto) e Lumican (marcador de ceratócitos). Imunoflurescência também foi feita após o tratamento. As células do estroma da córnea foram cobertas com colágeno (200?L e 500 ?L) e 0,1 % de riboflavina e exposta a luz UVA a 370nm por 30 minutos. Após 24 horas, citotoxicidade foi determinada por ensaio de MTT e a viabilidade celular foi feita por Hoechst 33342/Iodeto de propideo. Resultados: As culturas de células atingiram confluência em aproximadamente 20 dias. Imunofluorescência apontou alta expressão para o marcador de ceratócitos (Lumican) e expressão negativa par os marcadores de células epiteliais (K3), fibroblasto (Thy-1) e miofibroblasto (?-SMA). Após o cross linking a análise de MTT mostrou baixa taxa de toxicidade e com a coloração de Hoechst 33342/Iodeto de propideo baixa taxa de apoptose e necrose respectivamente em todos os grupos que continham colágeno. Conclusão: As culturas de ceratócitos foram obtidas e caracterizadas por imunofluorescência através do marcador Lumican com sucesso. O ensaio de MTT e a coloração por Hoechst 33342 e iodeto de propídio, apresentaram maior índice de morte celular nos grupos que não continha colágeno, provando que protege as células contra os efeitos da luz UVA.
URI: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46556
Other Identifiers: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=91997
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