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Title: Determinação da frequência alélica de polimorfismos de nucleotídeo único e análise de sua aplicação clínica na monitorização de quimerismo pós transplante de células hematopoéticas
Authors: Figueiredo, Maria Stella Figueiredo [UNIFESP]
Azevedo, Marily Maria de [UNIFESP]
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Keywords: chimerism
real time pcr
bone marrow transplantation
allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
quantitative pcr
single nucleotide polymorphism
quimerismo
pcr em tempo real
transplante de medula óssea
transplante de células troncos alogênico
pcr quantitativo
polimorfismo de nucleotídeo único
Issue Date: 31-Jul-2013
Publisher: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Citation: AZEVEDO, Marily Maria de. Determinação da frequência alélica de polimorfismos de nucleotídeo único e análise de sua aplicação clínica na monitorização de quimerismo pós transplante de células hematopoéticas. 2013. 12 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2013.
Abstract: The chimerism analysis has become a routine procedure after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell transplantation (HSCT) for early detection of relapse or graft failure. In recent years, various techniques have been described to evaluate chimerism. The basic principle of its detection is the utilization of differences between recipient and donor genomes. The most commonly used method is based on amplification of small tandem repeats (STR), with sensitivity ranging from 1 to 5%. This method is useful for documenting graft, but it is not sufficient for the detection of minimal residual disease or early relapse; situations where medical intervention is urgently needed. Currently, the Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) appear to be useful as molecular markers for monitoring chimerism after HSCT due to their stability, specificity and can be analyzed using quantitative methods sensitive. Objectives: 1. To determine the frequency of 12 polymorphisms in the Brazilian population to use them as a basis in developing an informative panel for chimerism analysis. 2. To realize a comparative analysis of techniques, such as STR, TaqMan qPCR and LNA, for identification and quantification of SNPs performed on samples from Brazilian and Canadian populations. Methods: Analyses of allele frequencies of SNPs rs668, rs5984, rs1800734 and rs1799854 were performed by allele-specific PCR (ASO-PCR) in the Brazilian population. SNPs rs4880, rs2269848, rs163781, rs10757713, rs1432622, rs713503, rs2296600 and rs715463 were performed with TaqMan methodology (MGB) and LNA. Chimerism analysis techniques were performed used STR, TaqMan (MGB) and LNA. Results and Discussion: The SNPs analysis showed an allele frequency of approximately 50% for the ancestral allele for each SNP in the Brazilian and Canadian populations, suggesting this panel can be useful in the analysis of chimerism. However, more studies are needed to determine the informativity of this panel. Specific SNPs analysis using TaqMan technology (MGB) have proved to be useful in determining chimerism, despite initial difficulties for determine an informative panel. The LNA technology initially proved to be more sensitive and specific technique, however, its reproducibility was not effective. Typical assays for chimerism analysis are expensive and time consuming. Variations can occur between SNPs, so each SNP needs to be validated individually before its clinical application. TaqMan MGB technique was considered the best option to save time and money compared to LNA and STR. Conclusions: Despite its cost and time spent for its execution, STR is the gold standard test to monitor chimerism after HSCT mainly due to be commercially available. The studied SNPs appear to be useful as molecular markers for monitoring chimerism after HSCT due to the allele frequency presented. Genotyping using qPCR assay has the potential to reduce time and medical costs, important factors in developing countries, such as Brazil.
A análise de quimerismo tornou-se um procedimento de rotina após Transplante Alogênico Hematopoético de Células Tronco (TCTH) para detecção precoce de recidiva da doença ou falência do enxerto. Nos últimos anos, técnicas diferentes de avaliação de quimerismo foram descritas. O princípio básico de sua detecção é a utilização de diferenças dos genomas entre receptor e doador. O método mais comumente usado baseia-se na amplificação das Pequenas Repetições em Tandem (STR), com sensibilidade variando de 1 a 5%. Este método é útil para documentação de enxerto, mas não suficiente para detecção de doença residual mínima ou recidiva precoce; situações onde a intervenção médica é urgente e necessária. Atualmente, os Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) parecem ser úteis como marcadores moleculares na monitorização do quimerismo pós-TCTH devido a sua estabilidade, especificidade e poderem ser analisados através de métodos quantitativos sensíveis. Objetivos: 1. Determinar a frequência de 12 polimorfismos na população brasileira para servir como base no desenvolvimento de um painel molecular informativo para análise de quimerismo; 2. Análise comparativa das técnicas STR, qPCR TaqMan e LNA para identificação e quantificação de SNPs realizada em amostras das populações brasileira e canadense. Métodos: As análises das frequências alélicas dos SNPs rs668, rs5984, rs1800734 e rs1799854 foram realizadas por PCR alelo-específico (ASO-PCR) na população brasileira. Os SNPs rs4880, rs2269848, rs163781, rs10757713, rs1432622, rs713503, rs2296600 e rs715463 foram investigados com as metodologias TaqMan (MGB) e/ou LNA. Para análise do quimerismo foram utilizadas as técnicas STR, TaqMan (MGB) e LNA. Resultados e Discussão: Os SNPs analisados apresentaram frequência alélica de aproximadamente 50% referente ao alelo ancestral para cada SNP, sugerindo que este painel possa ser útil na análise do quimerismo. No entanto, mais estudos ainda são necessários para determinar a informatividade real deste painel. SNPs específicos utilizando tecnologia TaqMan (MGB) mostraram-se úteis na determinação de quimerismo, apesar das dificuldades iniciais na determinação de um painel informativo. A tecnologia LNA inicialmente mostrou-se uma técnica mais sensível e especifica que a TaqMan (MGB), todavia, a sua reprodutibilidade não foi efetiva. Variações podem ocorrer entre SNPs, por isso, cada SNP necessita ser validado individualmente antes de sua aplicação clínica. Ganho de tempo e economia de dinheiro também foram analisados neste estudo, e a técnica TaqMan MGB foi considerada a melhor opção, quando comparada a LNA e STR. Conclusões: Apesar do custo e do tempo gasto para sua execução, o STR é teste padrão para a análise do quimerismo pós transplante de células tronco hematopoéticas, principalmente por ser comercialmente disponível. Entretanto, os SNPs estudados parecem ser úteis como marcadores moleculares na monitorização do quimerismo pós-TCTH devido a frequência alélica apresentada. A genotipagem utilizando ensaio qPCR parece ser promissora pois tem o potencial de reduzir tempo e custos médicos, sendo de grande importância em países em desenvolvimento como o Brasil.
URI: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46467
Other Identifiers: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=509820
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