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Title: Desenvolvimento de substratos de fluorescencia apagada para dosagem da enzima conversora de angiotensina I em plasma e tecidos
Other Titles: Continuously recording fluorescente assay for plasma and tissue angotensin I-converting enzyme activity
Authors: Alves, Marcio Fernando Madureira [UNIFESP]
Keywords: Peptidil Dipeptidase A
Substratos
Issue Date: 2001
Publisher: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Citation: São Paulo: [s.n.], 2001. 64 p. ilus.
Abstract: Desenvolvemos um metodo continuo para dosagem da enzima conversora de angiotensina I (ECA) em plasma e tecidos usando substratos com apagamento intramolecular de fluorescencia contendo os grupos Abz (acido orto-amino benzoico) e Dnp (2,4- dinitrofenil) como sonda fluorescente e supressor de fluorescencia, respectivamente. Substratos com formula geral Abz-peptidyl-X(Dnp)-P-OH (X= lisina ou acido 2,3 diamino propionico) sao hidrolisados pela ECA de forma eficiente disponibilizando um metodo rapido e sensivel de acompanhamento da atividade enzimatica. A hidrolise do substrato Abz-FRK(Dnp)P-OH pela ECA do plasma de 80 voluntarios foi monitorada atraves da leitura continua da fluorescencia, a 37ºC em tampao Tris-HCI 0.1 M, pH 7.0, contendo 50 mM de NaCI e 10 Nm de ZnCI. A especificidade do ensaio foi demonstrada pela inibicao da atividade enzimatica com 0.5 gM de captopril ou lisinopril. Os resultados obtidos com Hip-His-Leu e com Abz-FRK(Dnp)P-OH apresentaram um coeficiente de correlacao de 0.90. O ponto de clivagem determinado atraves do sequenciamento dos fragmentos separados em HPLC foi R-K(Dnp)-OH. As dosagens da ECA nos homogenatos de tecidos de rato (pulmao, figado, coracao e rim) foram feitas usando como substratos o AbzFRDap(Dnp)P-OH, Abz-FFDap(Dnp)P-OH e Abz-FLDap(Dnp)P-OH. Nesses ensaios os inibidores E64, pepstatina, PMSF, TPCK e TLCK foram acrescentados ao tampao de ensaio para se evitar hidrolises indesejadas. A especificidade do ensaio foi determinada pela inibicao da hidrolise na presenca de 0.5 gM de captopril ou lisinopril. O peptideo Abz-FRDap(Dnp)P-OH foi caracterizado como o substrato mais especifico nos ensaios para determinacao da ECA nos tecidos estudados. A ligacao clivada foi R-Dap(Dnp)-OH como determinado pelo sequenciamento dos fragmentos resultantes da hidrolise. Os resultados obtidos indicam que desenvolvemos um metodo rapido, sensivel e continuo para determinacao da atividade da ECA no plasma humano e em tecidos de rato
URI: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/17258
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