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Construção de bibliotecas de inibidores de serinoproteases em sistema phage display: seleção de inibidores para enzimas de Flavivírus e do mosquito Aedes aegypti
(Universidade Federal de São Paulo, 2023-02-09) Manzato, Verônica de Moraes [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]; Torquato, Ricardo José Soares [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3995278540776284; http://lattes.cnpq.br/1168789309568199; http://lattes.cnpq.br/3139881734780671
Introdução: No Brasil, ocorrem, de forma endêmica, arboviroses como Dengue, Zika, Chikungunya e Febre amarela, que possuem um vetor comum, o mosquito Aedes aegypti. As enzimas NS2B-NS3 dos flavivírus e as tripsinas nos Aedes aegypti desempenham funções essenciais no ciclo viral e na digestão de Aedes spp, respectivamente, o que justifica a busca por inibidores dessas enzimas como opções para romper esses ciclos. Nesse contexto, a técnica phage display tem sido uma aliada. Os inibidores Boophilina domínio 1 (D1) e Sunflower trypsin inhibitor (SFTI), são representantes das famílias de inibidores Kunitz-BPTI (I2) e sunflower cyclic trypsin inhibitor (família I12), respectivamente, e inibem serinoproteases na ordem de nano molar. Objetivo: Selecionar através da técnica de phage display, inibidores das bibliotecas BoophilinaD1 e SFTI, com a utilização de 3 alvos (proteases ZIKV, DENV2 e tripsina5607). Seguido pela caracterização cinética e in silico dos mutantes mais frequentes. Métodos: As proteases DENV2Pro e tripsina5607, foram expressas em bactéria E coli SHuffleT7 e purificadas por afinidade. As bibliotecas de inibidores foram sintetizadas utilizando técnicas moleculares de PCR, utilizando-se o plasmídeo pCANTAB5E e bactérias E. coli TG1. As seleções foram realizadas para enzimas do vírus ZIKVPro, DENV2Pro e do mosquito vetor tripsina5607. Os mutantes de BoophilinaD1 mais frequentes, selecionados para a enzima do ZIKVPro foram produzidos e utilizados nos ensaios cinéticos para determinação do perfil inibitório para as enzimas (ZIKVPro e DENV2Pro), utilizados também na modelagem, docking molecular e refinamento para as enzimas de flavivírus, via MODELLER, ClusPro e RosettaDock, respectivamente. Resultados: As enzimas alvo purificadas apresentaram bandas predominantes e ativas em torno de 28 e 26 kDa, para DENV2Pro e tripsina5607, respectivamente. A ZIKVPro usada nas seleções foi gentilmente cedida por Dr. Martin Wurtele. Os títulos das bibliotecas utilizadas nos processos de seleção foram de 2,9 x 106 CFU e 2,1 x 105 CFU para BoophilinaD1 e SFTI, respectivamente. Dentre os inibidores BophD1 mut selecionados, 76,5% apresentam aminoácido básico Arg ou Lys na posição P1 e 70,6% e 58,8% Ala na posição P1’e P4’, respectivamente. O inibidor BoophD1 WT e os BoophD1 mut12 e mut14 apresentam Ki entre 1 e 2 nM para tripsina bovina e aproximadamente 100 e 300 nM para as enzimas ZIKVPro e DENV2Pro, respectivamente. As análises in silico de docking molecular indicam diferenças de interação dos mutantes com as enzimas. Os mutantes da biblioteca SFTI selecionados para os três alvos são, em sua maioria, compartilhados e sem consenso. Subtraindo-se os ligantes inespecíficos, destaca-se as sequências (P1-P4’) ARQLL, KSQWD e LSRHP por serem representativas para ZIKVPro, DENV2Pro e tripsina5607, respectivamente. Esses SFTIs mutantes foram sintetizados e serão utilizados futuramente nos ensaios cinéticos para caracterização inibitória com diferentes alvos. Discussão: As enzimas proteolíticas desempenham papéis importantes em diversas funções, no caso das DENV2Pro e ZIKVPro, estão relacionadas com a clivagem da poliproteína e no caso da tripsina5607, relacionada a digestão de proteínas ingeridas pela larva de Ae. aegypti. Obtê-las de forma recombinante, solúvel e ativa é importante para aprofundar nossos conhecimentos sobre elas e fornecem informações para o desenvolvimento de inibidores com alta afinidade, podendo ser um inibidor específico ou pan-inibidores (para diferentes flavivírus). Conclusão: Este trabalho traz dados importantes sobre a busca de inibidores para as proteases de flavivírus e de mosquito utilizando bibliotecas de inibidores em sistema phage display. Inibidores para ZIKVPro foram selecionados por phage display e apresentaram constantes de inibição em 10-7 M assim como para a DENV2Pro, estes resultados sugerem que os inibidores selecionados são candidatos a pan-inibidores para proteases de flavivírus.
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Expressão e purificação do domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína Spike do vírus SARS-Cov-2 da cepa de Wuhan
(Universidade Federal de São Paulo, 2024-04-03) Vaz, Fábio Antonio Busoli [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1168789309568199; http://lattes.cnpq.br/0752962071052417
Objetivos: O objetivo foi a obtenção da RBD de SARS-CoV-2 e realizar estudos de expressão, solubilização e purificação da RBD-wt recombinante a fim de encontrar uma condição ótima. Métodos: A construção plasmidial contendo a RBD-wt utilizada para obtenção da variante P1 por meio da estratégia de mutação sítio-dirigida por reações de PCR. O fragmento de DNA foi purificado e inserido no vetor pRSET-A. O DNA plasmidial da construção contendo a RBD-wt foi utilizado na transformação de células BL21(DE3) pLysS competentes, por choque térmico e, após a confirmação dos clones positivos, foram feitos os testes de expressão a fim de otimizar a produção da RBD-wt recombinante. Após os testes de expressão, foi realizado um teste de solubilidade e foi feita a detecção da RBD-wt por Western Blot. Após esses testes, foi feita a purificação da RBD-wt usando dois métodos diferentes de expressão para obter a proteína recombinante. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade. Resultados: Bactérias transformadas com plasmídeos contendo a sequência da RBD-wt foram confirmadas por PCR de colônia. Os clones positivos foram utilizados para a expressão da proteína recombinante que foi confirmada por SDS-PAGE apresentando uma banda proteica de aproximadamente 32 kDa. Um clone positivo foi utilizado para os testes de expressão, sob diferentes concentrações do agente indutor, tempos de incubação e temperaturas. Os resultados mostraram que as concentrações testadas do indutor não afetaram a expressão da proteína. Contudo, o tempo de incubação e a temperatura afetaram os níveis de expressão. As melhores condições observadas para a expressão de RBD-wt foram utilizando o meio de autoindução. A proteína RBD-wt recombinante foi obtida majoritariamente na forma insolúvel, dados confirmados por SDS-PAGE e Western Blotting. A proteína recombinante foi solubilizada em 8 M de ureia e purificada por cromatografia de afinidade em coluna His-Sepharose, sendo realizado o refolding dentro da coluna. Desta forma, a proteína solúvel foi obtida na eluição. A construção plasmidial contendo a sequência da RBD-P1 foi obtida com sucesso utilizando mutação sítio-dirigida e a sequência da RBD-wt como DNA-molde. A sequência correta foi confirmada por sequenciamento DNA. Conclusão: Dentre as condições testadas para a expressão da RBD-wt, não foi observado uma condição que aumentasse o rendimento da proteína recombinante solúvel quando comparada com as condições de solubilização e refolding publicadas anteriormente. Neste trabalho foi possível obter a construção plasmidial contendo a sequência de RBD-P1, que poderá ser utilizada em estudos futuros.
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Characterization of astrocyte subpopulations after hypoxia in vitro
(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-13) Courbassier, Natália Rodrigues [UNIFESP]; Porcionatto, Marimélia Aparecida [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6155537170968904; http://lattes.cnpq.br/2039026333783706
Astrocytes become reactive after a Central Nervous System (CNS) injury, passing by phenotypic changes (mainly hypertrophy and gene expression modifications), which can include proliferation and dedifferentiation. Physiologically, astrocytes are very heterogenous cells, they can vary according to region, layer location, morphology, age,and others. Given their heterogeneity, a growing body of literature has been sought to unravel astrocytespecific functions and signatures. Such heterogeneity extends to their reactive state, which is not a uniform response but rather possesses high complexity varying according to stimulus nature and intensity. Previously, our Lab described Notch signaling activation on astrocyte reactivity in vivo and in vitro of brain damage by traumatic brain injury. In addition, we studied the influence of several biomaterials' stiffness on astrocyte reactivity and their morphological response in vitro. In both studies reactive astrocytes showed an aggregation pattern characterized by nonhomogeneous distribution at culture dish. Here, we sought to evaluate whether hypoxia would promote astrocyte reactivity and induce their aggregation in vitro. Further, we characterized astrocyte subpopulation profiles considering their maturity state and expression of reactive protein markers. The brain is one of the most sensitive organs to hypoxia due to its high energy supply required to maintain its proper function. Hypoxia/ischemia have been extensively used as an experimental target in a wide range of studies. However, there is a lack of hypoxia outcome itself, a condition observed in perinatal hypoxia. Here, we observed morphological changes after hypoxia. However, gene expression of the main reactivity markers of astrocytes remained unaltered. For the first time we described an astrocytes aggregation pattern in vitro in response to hypoxia. The molecular and cellular characterization of astrocytes in physiological and pathological conditions can provide higher comprehension about their role in health and disease, such knowledge can uncover mechanisms that underlies its response to achieve regenerative medicine advances.
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Estratégias de intervenção precoce, estigma e práticas orientadas ao recovery na atenção ao primeiro episódio psicótico: uma comparação entre Centros de Atenção Psicossocial e Ambulatório Universitário Especializado
(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-21) Soeiro, Pâmela Pilar Molino [UNIFESP]; Noto, Cristiano de Souza [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8903154232209770; https://lattes.cnpq.br/0480742184296245
Introdução: No âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS), a Rede de Atenção Psicossocial (RAPS) fica responsável pela oferta da assistência à saúde mental pública no Brasil, tendo o Centro de Atenção Psicossocial (CAPS) como ponto estratégico no gerenciamento do cuidado. Por essas diretrizes, observou-se que, a literatura existente demonstra os benefícios da intervenção precoce nas psicoses iniciais; entretanto, pôde-se também notar que, barreiras como o estigma e a baixa perspectiva de recuperação podem impactar nos serviços oferecidos por essas organizações de atendimentos especializados. Materiais e Métodos: Este estudo de observação transversal comparou as estratégias de intervenção precoce nas psicoses experienciadas entre o CAPS adulto, o CAPS infantojuvenil e um ambulatório universitário especializado em primeiro episódio psicótico (Grupo de Apoio às Psicoses Iniciais - GAPi) da cidade de São Paulo. A princípio, a escala FEPS-FS (First Episode Psychosis Services Fidelity Scale) foi utilizada para identificar as estratégias de intervenção precoce às psicoses nas unidades de saúde mental. Secundariamente, a percepção da equipe em relação as práticas orientadas ao recovery dos serviços, também foi avaliada. Para isso, usou-se a escala RSA-R (Recovery Self-Assessment) e o nível de estigma dos profissionais das equipes, através do Questionário de Estigma. Resultados: Os resultados obtidos por esse processo mostraram os seguintes efeitos: 1). Que a escala FEPS tem um ponto de corte de 124 para resultados satisfatórios; enquanto, o GAPi pontuou 123. Uma estimativa que indica a necessidade de melhorias em estratégias de intervenção precoce. 2). Que as pontuações dos CAPS na escala FEPS variaram de 81 a 99. Uma estimativa que sinaliza práticas abaixo do esperado para os programas de intervenção precoce (com o CAPS infantojuvenil pontuando um nível mais alto do que o CAPS adulto). 3). Que há uma correlação negativa e significativa entre as escalas FEPS-FS e RSA-R, que indica quando o resultado de um instrumento pode aumentar e o outro diminuir nos locais estudados. Além disso, não houve diferenças significativas na presença de estigma entre o CAPS e o GAPi. Conclusões: Foi constatado que, programas e estratégias de intervenção precoce podem ampliar o acesso, ao passo que, a integração no SUS e seus impactos, ainda necessitam de estudos futuros. Nisto, o desenvolvimento de estudos sobre a integração destes programas nos CAPS demonstrou ser crucial para o entendimento de seu impacto na triagem, no recovery e no combate ao estigma.
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Folder de Termorregulação Neonatal
(Escola Paulista de Enfermagem (EPE), 2024) Santos, Cybelle [UNIFESP]; Bernardo, Rayane [UNIFESP]; Santos, Sthefany [UNIFESP]; Melo, Alice [UNIFESP]; Mota, Fernanda [UNIFESP]; Lemes, Stephani [UNIFESP]; Guareschi, Ana Paula Dias França [UNIFESP]; https://lattes.cnpq.br/5580929216919134; http://lattes.cnpq.br/4209449928426580
Folder elaborado durante curricularização na UC Neonatologia