Nudel-oligopeptidase: análise da distribuição do RNAm no SNC de ratos neonatos e adultos e caracterização do resíduo crítico para a atividade catalítica

Nudel-oligopeptidase: análise da distribuição do RNAm no SNC de ratos neonatos e adultos e caracterização do resíduo crítico para a atividade catalítica

Título alternativo Nudel-oligopeptidase: analysis of mRNA distribution in the central nervous system (CNS) of newborn and adult rats, and characterization of the amino acid residue critical for the catalytic activity
Autor Bastos, Marta Ferreira Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Camargo, Antonio Carlos Martins de Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Resumo Thirty years ago the first endooligopeptidases were described, and named Endo A (EOPA) and Endo B. EOPA was later characterized as a thiol-activated peptidase showing specificity for substrates comprising 7 to 13 amino acid residues. In 2000, studying the molecular mechanisms of the brain disorder lissencephaly, three independent groups isolated a protein named NUDEL (nuclear distributing-like protein), in a screen for LIS1 interacting proteins, and showed that it is essential for neuronal migration and axonal outgrowth during brain development. Surprisingly, the cDNA and the deduced amino acid sequences of NUDEL revealed to be the same molecule as EOPA, and in 2005 the name NUDEL-oligopeptidase was suggested. Recently, NUDELoligopeptidase was also identified as the protein that binds to several proteins found in neuronal cells, such as Lis1, dineyn, DISC1, neurofilaments, suggesting its involvement in the Developmental processes and maintenance of the CNS. The first aim of this work was to map the distribution of the NUDEL-oligopeptidase mRNA in different areas of the CNS of rats at different ages, using the in situ hybridization, Northern Blotting and RTPCR methods. Different regions of the CNS showed some level of NUDELoligopeptidase expression, while the neocortex and the hippocampus clearly presented the highest levels, a fact that was observed for all analyzed age groups. In fact, the hippocampal region showed higher levels in the younger animals (5, 10 and 15 days), while the neocortex region showed higher levels in 90 days old animals. The second aim of the present work was to determine the critical cysteine residue for the catalytic activity of the NUDEL-oligopeptidase, using the site-directed mutagenesis method. The three cysteine residues found in the deduced amino acid sequence at positions 203, 273 and 293 of the NUDEL-oligopeptidase protein were mutagenized and expressed. The enzymatic analysis of recombinant wild-type and mutants proteins showed that the cysteine residue at position 273 is essential for the catalytic activity of the NUDELoligopeptidase.

Em meados dos anos 70 foram descritas as primeiras endooligopeptidases, nomeadas Endo A (EOPA) e Endo B. Posteriormente, a EOPA foi caracterizada como uma cisteíno peptidase com afinidade por substratos de tamanho específico contendo de 7 a 13 resíduos de aminoácidos. Em 2000, grupos independentes trabalhando com os mecanismos envolvidos em uma patologia denominada lisencefalia descreveram a fundamental participação de uma proteína denominada NUDEL para o desenvolvimento do SNC. A análise da seqüência das duas moléculas revelou que tratava-se da mesma proteína, e em 2005 foi sugerida sua denominação como NUDEL-oligopeptidase. Recentemente, foi demonstrado que a NUDEL se associa à diversas proteínaspresentes em células neuronais como Lis1, dineína, DISC1, neurofilamentos, sugerindo seu envolvimento nos processos de desenvolvimento e manutenção do SNC. Este trabalho teve como primeiro objetivo avaliar a distribuição do RNAm codificante para NUDEL-oligopeptidase no SNC de ratos com diferentes idades utilizando as técnicas de hibridização in situ, Northern Blotting e RT-PCR. Foi possível observar a distribuição do RNAm codificante para NUDEL-oligopeptidase em diferentes regiões do SNC, destacando neocórtex e hipocampo como as regiões com maiores níveis de expressão. Nestas regiões também foram determinadas diferenças significativas nos níveis de expressão para as diferentes idades analisadas. Na região hipocampal níveis mais elevados foram observados para os animais mais jovens (5, 10 e 15 dias) enquanto que para a região de neocórtex, níveis mais elevados foram observados no animal de 90 dias. O segundo objetivo do presente trabalho foi de determinar o resíduo de cisteína crítico para a atividade catalítica da NUDEL-oligopeptidase, utilizando a técnica de mutagênese sítio dirigida. Por meio da análise da seqüência deduzida de aminoácidos foi possível identificar a presença de três resíduos de cisteína nas posições 203, 273 e 293 da molécula de NUDEL-oligopeptidase. A análise da atividade enzimática das proteínas recombinantes mutadas e selvagem determinaram que a cisteína de posição 273 na seqüência de aminoácidos é responsável pela atividade enzimática da molécula. Estudos futuros que determinem a influência da atividade enzimática da NUDELoligopeptidase nas diferentes regiões do SNC de indivíduos normais e de portadores de neuropatologias serão de grande importância para o entender a importância da NUDELoligopeptidase no desenvolvimento e na manutenção das funções normais do SNC.
Palavra-chave Mutação sítio dirigida
Desenvolvimento do SNC
Hibridização in situ
Neuropatologias
Oligopeptidase
Idioma Português
Data de publicação 2006-01-01
Publicado em BASTOS, Marta Ferreira. Nudel-oligopeptidase: análise da distribuição do RNAm no SNC de ratos neonatos e adultos e caracterização do resíduo crítico para a atividade catalítica. 2006. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2006.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 141 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9846

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