Mecanismos genômicos e não-genômicos de controle da sinalização do AMP cíclico

Mecanismos genômicos e não-genômicos de controle da sinalização do AMP cíclico

Título alternativo Genomic and non-genomic control mechanisms of the cyclic AMP signaling
Autor Chiavegatti, Tiago Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Godinho, Rosely Oliveira Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Farmacologia – São Paulo
Resumo cyclic AMP (cAMP)-mediated pathway regulates several aspects of muscle and neuromuscular synapse physiology such as anabolism, neurotransmitter release and expression and function of crucial synaptic proteins like acetylcholinesterase (AChE) and nicotinic receptors, not to mention muscle contraction itself. The synthesis of this second messenger is mediated by stimulatory G protein coupled receptors (GsPCR), which activate adenylyl cyclase (AC), the enzyme that converts ATP in cAMP. Until now, nine different membrane-bound AC isoforms (AC1–AC9) are known, each one of them with different regulatory and enzymatic properties. Previous studies from our group showed that long-term stimulation (24 h) with the neuropeptide CGRP, a GsPCR agonist, or forskolin (FSK), a direct activator of isoforms AC1–AC8, attenuates AChE expression and cAMP formation induced by a subsequent stimulus, suggesting an adaptative mechanism of the muscle fiber in response to superstimulation (da Costa, Lapa and Godinho 2001). Besides, AC activation leads to extracellular accumulation of cAMP through probenecide-sensitive transporters (Godinho and Costa-Jr, 2003). Outside the cell, the cyclic nucleotide is converted into adenosine through the extracellular cAMP–adenosine pathway, suggesting an extracellular autocrine action of this second messenger (Chiavegatti 2005; Chiavegatti et al. 2008). Thus, the objective of this work was to: a) evaluate the expression pattern of AC isoforms in fast (extensor digitorum longus, EDL) and slow (soleus) muscles or cultured rat skeletal muscle; b) determine the mechanisms responsible for the diminished cAMP synthesis after long-term stimulation; and c) to analyze the role of the extracellular cAMP–adenosine pathway on the intracellular cyclic nucleotide signaling. RT-PCR analysis revealed transcripts for isoforms AC2–AC9 in EDL, soleus, primary culture and L6 cells. Confirming previous results, long-term stimulation (24 h) of AC with FSK reduced the cAMP generation by subsequent treatment with FSK, isoproterenol (ISO) or CGRP. This effect was explained by the down-regulation of AC detected by 3H-FSK binding assay. In addition, treatment with FSK for 24 h reduced the affinity of the enzyme for its substrate ATP, while long-term stimulation with CGRP or ISO increased the affinity for the substrate and reduced Vmax, indicating that direct- or G protein-mediated continuous activation has different effects on AC regulation. Long-term stimulation with FSK also reduced the mRNA for AC5, AC6 and AC9, while transcripts for AC2 and AC4 were increased, demonstrating a differential regulation of AC isoforms under superstimulation. On the other hand, the basal activity of AC was increased in membranes from cultures stimulated for 24 h with ISO or FSK. The sensitization of AC was confirmed by the increased cAMP generation in membranes from cells treated for 12 h with ISO or FSK and allowed to recover for 24 h. Denervation also increased AC activity, increasing Vmax and Km on soleus muscles, but not in EDL. At the same time, denervation reduced the amount of mRNA for AC2 but not for AC9 in soleus, while the expression of these two isoforms remained unchanged in EDL and diaphragm muscles, suggesting that the effect of denervation on AC depend on trophic properties of each muscle. Finally, we demonstrated that the extracellular cAMP¡Vadenosine pathway acts in an autocrine fashion on adenosine receptors coupled to GƒÑs, providing a positive feedback response to intracellular cAMP signalling on the skeletal muscle fibers. These results indicate that cAMP signaling on skeletal muscle may be regulated by multiple mechanisms, including genomic and intra- or extracellular non-genomic pathways that may be targets for new pharmacological interventions.

A via de sinalização do AMP cíclico (AMPc) modula vários aspectos da fisiologia do músculo esquelético e da sinapse neuromuscular, como o trofismo muscular, a liberação de neurotransmissores, a expressão e a dessensibilização de proteínas sinápticas cruciais, tais como a acetilcolinesterase (AChE) e os receptores nicotínicos, além da própria contração. A síntese deste segundo-mensageiro é mediada principalmente pela ativação de receptores acoplados à proteína G estimulatória (GsPCR), que ativam a enzima adenilil ciclase (AC), responsável pela conversão do ATP em AMPc. Até o momento, são conhecidas nove diferentes isoformas de AC associadas à membrana (AC1–AC9), com diferentes propriedades regulatórias e enzimáticas. Estudos realizados em nosso laboratório demonstraram que tratamentos prolongados (24 h) com neuropeptídeo CGRP, um agonista de GsPCR, ou forscolina (FSK), um ativador direto das isoformas AC1–AC8, atenuam a síntese de AChE e a formação de AMPc induzidas por uma estimulação subseqüente, sugerindo um mecanismo adaptativo da fibra muscular em resposta à superestimulação (da Costa, Lapa e Godinho 2001). Além disso, a estimulação da AC leva ao acúmulo extracelular do AMPc através de transportadores sensíveis à probenecida (Godinho e Costa-Jr 2003). Fora da célula, o nucleotídeo cíclico é convertido em adenosina através da via extracelular AMPc–adenosina, sugerindo uma ação autócrina extracelular deste segundo-mensageiro (Chiavegatti et al. 2008; Chiavegatti 2005). Assim, este trabalho teve como objetivos: a) determinar os mecanismos responsáveis pela diminuição da capacidade de síntese do AMPc após estímulos prolongados, e b) analisar o papel da via extracelular AMPc–adenosina na sinalização intracelular do nucleotídeo cíclico. Para isso, estudamos a expressão das isoformas de AC associadas à membrana no músculo esquelético através de RT-PCR. Foram detectados transcritos para todas as isoformas AC2–AC9 em EDL, sóleo, cultura primária e células L6. Confirmando resultados anteriores, a estimulação prolongada por 24 h das AC com FSK atenuou a resposta de estímulos subseqüentes com FSK, isoproterenol (ISO) ou CGRP. Este efeito foi explicado pela downregulation da enzima, detectado por ensaios de ligação da 3H-FSK. Além disso, o tratamento por 24 h com FSK diminuiu a afinidade da AC pelo ATP, enquanto a estimulação prolongada com CGRP ou ISO aumentou a afinidade pelo substrato ao mesmo tempo em que reduziu a Vmax da enzima, indicando que a ativação direta ou mediada pela proteína G têm efeitos distintos na regulação da AC. A análise dos transcritos das isoformas de AC revelou que a estimulacao persistente reduz a quantidade de RNAm para AC5, AC6 e AC9 e aumentou os transcritos para AC2 e AC4, demonstrando uma regulacao diferencial das isoformas em situacoes de superestimulacao. Alem disso, observamos aumento da atividade basal da AC de membranas provenientes de culturas estimuladas por 24 h com FSK ou ISO. Esta sensibilizacao da AC foi confirmada pela potencializacao da sintese do AMPc em membranas de celulas submetidas a pre-tratamento por 12 h com ISO ou FSK, seguido de recuperacao por 24 h. A desnervacao tambem modificou a atividade da AC, aumentando Vmax e Km da enzima em soleo, mas nao em EDL. Ainda, a desnervacao reduziu a quantidade de RNAm da AC2, mas nao o da AC9, no musculo soleo, enquanto a expressao destas duas isoformas permaneceu constante em EDL e diafragma, sugerindo que o efeito da desnervacao na AC depende das caracteristicas troficas de cada musculo. Por fim, demonstramos que a via extracelular AMP ciclico¡Vadenosina age de forma autocrina em purinoceptores especificos acoplados a proteina GƒÑs e se constitui um mecanismo de retroalimentacao positiva da via de sinalizacao do AMP ciclico na fibra muscular esqueletica. Estes resultados indicam multiplas possibilidades de regulacao da sinalizacao do AMPc no musculo esqueletico, incluindo mecanismos genomicos e nao-genomicos intra e extracelulares, que podem fornecer novos alvos terapeuticos.
Palavra-chave Adenilil ciclase
Expressão gênica
Músculo esquelético
Sinalização celular
AMP cíclico
Idioma Português
Data de publicação 2009-07-29
Publicado em CHIAVEGATTI, Tiago. Mecanismos genômicos e não-genômicos de controle da sinalização do AMP cíclico. 2009. 137 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2009.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 137 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9803

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Nome: Restrito-00294.pdf
Tamanho: 1.430MB
Formato: PDF
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