Heparinases: clonagem, expressão e requisitos estruturais para a atividade

Heparinases: clonagem, expressão e requisitos estruturais para a atividade

Título alternativo Heparinases: cloning, expression and structural requirements for activity
Autor Córdula, Carolina Ribeiro Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Nader, Helena Bonciani Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Resumo Structural characteristics of heparin (Hep) and heparan sulfate (HS) have been determined using enzymes from Flavobacterium heparinum, a non-pathogenic soil bacterium. Upon induction with Hep/HS or their disaccharides as the sole source of carbon and nitrogen, the bacteria synthesize heparinase, and heparitinases I and II. This lyases cleaves heparin and HS by a -eliminative process in a random endolytic pattern. Heparitinase I cleaves exclusively Nacetyl or N-sulfo-glucosaminide-glucuronic acid linkage of HS/Hep without C6 sulfate substitution; Heparitinase II cleaves N-acetyl-6-sulfo or N-sulfo or N,6- sulfo glucosaminide-glucuronic/ iduronic acid linkage of HS/Hep without C3 sulfate substitution. Heparinase cleaves an -D-glucosamine N- and 6-sulfated (14) -L-iduronate 2-sulfated, present in heparin. This work aims to cloning and express heparinase and heparitinase I and study de kinetic behavior of heparinase. Recombinant enzymes were expressed in E. coli using the T7 polymerase pET expression system. The work shows that heparin-Ca2+- heparinase I complex is the true substrate for heparinase (KS = 1.4±0.1μM), whereas heparin Ca2+ free (KI=12±2μM) as an important pharmaceutical contaminant of commercial heparin, oversulfate chondroitin sulfate (OSCS) (Ki= 0.65μM) are competitive inhibitors. The pKa values of the prototropic groups of the active site were determined by measuring the pH-, solvent- and temperature-dependence upon kcat/KSA, kcat and KSA constants. The results show, at pHoptimium=6.67±0.05, a deprotonated histidine residue initiating the - elimination reaction by the abstraction of the C5 proton of the -L-iduronate 2- O-sulfate residue; and a tyrosin residue in a protonated form acting as a proton donor to the hexosamine leaving group. Mutations of histidine 165 and glutamine 163 residue were performed and kinetic analysis show specific activity maintenance (5,0 e-007 Abs/μg.s), suggesting that H165 and Q163 were not essencial for the heparinase activity.

Características estruturais de heparina (Hep) e heparam sulfato (HS) têm sido determinadas usando enzima de Flavobacterium heparinum, uma bactéria de solo, não-patogênica. Sob indução com Hep/HS ou seus dissacarídeos como única fonte de carbono e nitrogênio, a bactéria sintetiza heparinase e heparitinases I e II. Essas liases clivam heparina e HS por um processo - eliminativo em um padrão endolítico aleatório. Heparitinase I cliva exclusivamente ligações -D-glucosamina N-acetilada ou N-sulfatada (14) β- D-glucuronato de HS/Hep sem haver substituição de sulfato em C6; Heparitinase II cliva ligações -D-glucosamina N-acetil-6-sulfato ou N-sulfato ou N,6-sulfato (14) β-D-glucuronato ou -L- iduronato de HS/Hep, sem haver substituição de sulfato em C3. Heparinase cliva uma -D-glucosamina N- e 6- sulfato (14) -L- iduronato 2-sulfato, presente em heparina. Este trabalho objetiva clonar e expressar heparinase e heparitinase I e estudar o comportamento cinético da heparinase. As enzimas recombinantes foram expressas em E. coli usando o sistema de expressão pET T7 polimerase. O trabalho mostrou que o complexo heparina-Ca2+-heparinase é o substrato verdadeiro para heparinase (KS = 1.4±0.1μM), enquanto que tanto a heparina livre de Ca2+ (KI= 12±2μM) como também um importante contaminante farmacêutico de heparina comercial, condroitim sulfato super sulfatado (OSCS) (KI= 0.65μM) são inibidores competitivos. Os valores de pKa dos grupos prototrópicos do sítio ativo foram determinados pela medida pH-, solvente- e temperatura-dependente sobre as contantes kcat/KS, kcat e KS. Os resultados mostram, em pHótimo=6.67±0.05, um resíduo de histidina desprotonada iniciando a reação de -eliminação pela abstração do próton de C5 do resíduo -L-iduronato 2-O-sulfato; e um resíduo de tirosina na forma protonada agindo como um doador de próton para o anel de hexosamina liberada. Mutações dos residues de histidina 165 e glutamina 163 foram realizadas e análises cinéticas mostraram a manutenção da atividade específica (5,0 e-007 Abs/μg.s), sugerindo que os resíduos H165 e Q163 não são essenciais para a atividade da heparinase.
Palavra-chave clonagem
enzima
heparina
heparinase
Idioma Português
Data de publicação 2011-04-27
Publicado em CÓRDULA, Carolina Ribeiro. Heparinases: Clonagem, Expressão e Requisitos Estruturais para a Atividade. 2011. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2011.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9688

Exibir registro completo




Arquivo

Nome: Retido-12699a.pdf
Tamanho: 1.930MB
Formato: PDF
Descrição:
Abrir arquivo
Nome: Retido-12699b.pdf
Tamanho: 1.086MB
Formato: PDF
Descrição:
Abrir arquivo
Nome: Retido-12699c.pdf
Tamanho: 1.515MB
Formato: PDF
Descrição:
Abrir arquivo
Nome: Retido-12699d.pdf
Tamanho: 643.3KB
Formato: PDF
Descrição:
Abrir arquivo

Este item está nas seguintes coleções

Buscar


Navegar

Minha conta