Expressão da proteína Ras em células endoteliais é dependente de S indecam-4.

Expressão da proteína Ras em células endoteliais é dependente de S indecam-4.

Author Cavalheiro, Renan Pelluzzi Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Nader, Helena Bonciani Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Abstract Heparan sulfate (HS) plays an important role in cell behavior due to its ability to interact with a variety of molecules modulating growth factors and enzymes. HS participates in cellular signaling, and the activation of downstream pathways is related to the phosphorylation of cytosolic proteins leading to gene regulation. Previous studies show that syndecan-4 (Syn4), a heparan sulfate proteoglycan, modulates cell adhesion and is involved in the regulation of cell cycle. Thus the aim of the present work was to promote Syn4 knock down on endothelial cells using small hairpin RNA (shRNA) in order to gather information on its effect on cell behavior. For comparison, shRNA-Syn4-EC cells were simultaneously investigated with wild type endothelial cells (EC), as well as endothelial cells that overexpress ras oncogene (EJ-ras-EC) and a control that was transfected with the empty plasmideo (mock EC). The different cells were evaluated regarding the expression of Ras protein (Ras), b1-integrin (b1), fibronectin (FN), biglycan (Big), vascular endothelial growth factor (VEGF), von Willebrand factor (vWF), besides the core protein for syndecan-4 (Syn4) by flow cytometry and confocal microscopy. Clones were selected through sqPCR for Syn4 and [35S]-sulfate incorporation into heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) chains. Regardless of the transfection, the expression of vWF, an endothelial cell marker, was maintained in all cells, confirming their endothelial origin. The expression of syndecan-4 and incorporation of [35S]- sulfate varied among the different clones of shRNA-Syn4-EC up to 80%. The knockdown of Syn4 lead to significant reduction in the expression of Ras, b-1 integrin and FN, when compared to wild type cells as well as EJ-ras-EC. The overexpression of Ras leads to an overexpression of Syn4 and a decrease in VEGF expression and cellular localization of b-1 integrin. Furthermore, shRNASyn4- EC shows weak adhesion to the substrate, indicating that the lack of Syn4 altered cell-cell and cell-matrix interactions. The combined results clearly show that Syn4 plays an important role in cellular biology.

O heparam sulfato (HS) tem importante papel no comportamento celular devido a sua capacidade de interagir com uma variedade de moléculas, tais como fatores de crescimento e enzimas. HS está envolvido na sinalização celular, e a ativação da cascata de sinalização está relacionada com a fosforilação de proteínas citosólicas, que levam à regulação gênica. Estudos anteriores mostram que o sindecam-4 (Syn4), um proteoglicano de heparam sulfato, está envolvido na modulação da adesão celular e na regulação do ciclo celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi promover o “knock-down” do Syn4 em células endoteliais, pela utilização de pequenos RNAs em forma de grampo (shRNA) para um melhor entendimento da importância do Syn4 na sobrevivência celular. Células shRNA-Syn4-EC foram comparativamente estudadas com células endoteliais selvagens (EC), com células endoteliais que super-expressam o oncogene ras (EJ-ras-EC) e com células transfectadas com o plasmídeo vazio (mock EC). As diferentes células foram avaliadas por citometria de fluxo e microscopia confocal quanto à expressão da proteína Ras (Ras), integrina b1 (b1), fibronectina (FN), biglicam (Big), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de Von Willebrand (vWF), além do esqueleto protéico do sindecam-4. Os clones foram selecionados por PCRsq para o Syn4 e incorporação de [35S]-sulfato nas cadeias de glicosaminoglicanos. A transfecção não alterou a expressão de vWF que é um marcador de células endoteliais. A expressão do sindecam-4 e incorporação de [35S]-sulfato variou nos diferentes clones de shRNA-Syn4-EC em até 80%. O “knock-down” do Syn4 levou à redução significativa na expressão de Ras, integrina b-1, e fibronectina, quando comparado com células endoteliais selvagens, bem como com EJ-ras-EC. Por outro lado, a super-expressão de Ras levou à superexpressão de Syn4, diminuição da expressão de VEGF e alteração na localização celular da integrina b-1. Além disso, as células shRNA-Syn4-EC apresentam fraca adesão ao substrato, indicando que a ausência de Syn4 leva à alteração nas interações célula-célula e célula-matriz. Todos esses resultados mostram claramente que o Syn4 exerce importante papel na biologia celular.
Keywords Oncogene EJ-ras
RNA de interferência
Sinalização celular
Sindecam-4
Proteoglicanos
Language Portuguese
Date 2009-07-29
Published in CAVALHEIRO, Renan Pelluzzi. Expressão da proteína Ras em células endoteliais é depente de sindecam-4. . 2009. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2009.
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 96 p.
Access rights Open access Open Access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9615

Show full item record




File

Name: Publico-12671a.pdf
Size: 457.8Kb
Format: PDF
Description:
Open file
Name: Publico-12671b.pdf
Size: 728.2Kb
Format: PDF
Description:
Open file
Name: Publico-12671c.pdf
Size: 1.578Mb
Format: PDF
Description:
Open file
Name: Publico-12671d.pdf
Size: 1.855Mb
Format: PDF
Description:
Open file
Name: Publico-12671e.pdf
Size: 132.4Kb
Format: PDF
Description:
Open file

This item appears in the following Collection(s)

Search


Browse

Statistics

My Account