Estudos moleculares de enzimas do tipo tripsina presentes no intestino médio de larvas de Aedes aegypti

Estudos moleculares de enzimas do tipo tripsina presentes no intestino médio de larvas de Aedes aegypti

Título alternativo Molecular studies of trypsin-like enzymes present in midgut of Aedes aegypti larvae
Autor Soares, Tatiane Sanches Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Tanaka, Aparecida Sadae Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Resumo Aedes aegypti is the most important vector of human arboviral diseases and it is responsible for dengue and urban yellow fever transmissions. Trypsin-like enzymes plays an important role in the Ae. aegypti adult and larval life stages digestion. In the present work, we identified the two major trypsin-like enzymes of Ae. aegypti larval midgut through the trypsin cDNA fragments library construction. They are AAEL005607 and AAEL006371, with expression frequencies of 29.3% and 20%, respectively. Semi quantitative PCR analysis showed that the AAEL005607 was transcripted in all larval instars, but AAEL006371 appeared only in 3rd and 4th larval instars. In order to confirm the transcription data, trypsin-like enzymes from 4th instar larvae of Ae. aegypti midgut were purified by affinity, ionic exchange and reversedphase chromatographies. Purified trypsin presented molecular mass of 28 kDa by SDS-PAGE. Its partial amino acid sequence allowed us to suggest that the trypsin activity is encoding by AAEL005607 sequence. The purified trypsin (AAEL005607) showed Km value of 36.4 μM for Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa substrate and was strongly inhibited by AaTI and HiTI, both trypsin inhibitors, with Ki of 0.94 pM and 160 pM, respectively. In conclusion, for the first time, the major digestive enzyme of 4th larval instar of Ae. aegypti was identified and characterized.

O Aedes aegypti é o vetor mais importante de arboviroses humana sendo responsável pelas transmissões de dengue e febre amarela urbana. As enzimas tipo tripsina apresentam um importante papel na digestão de estádios de vida larval e adulto de Ae. aegypti. No presente trabalho, nós identificamos as duas enzimas tipo tripsina majoritárias do intestino médio larval através da construção de uma biblioteca de fragmentos de cDNA de tripsina. Elas são AAEL005607 e AAEL006371, com frequências de expressão de 29,3% e 20%, respectivamente. Análises por PCR semi-quantitativo mostraram que a tripsina AAEL005607 foi transcrita em todos os instars larval, mas a tripsina AAEL006371 apareceu somente nos 3º e 4º instar larvais. A fim de confirmar os dados de transcrição, enzimas tipo tripsina do intestino médio de larvas de 4º instar foram purificadas por cromatografias de afinidade, troca iônica e fase reversa. A tripsina purificada apresentou massa molecular de 28 kDa por SDS-PAGE. Sua sequência de aminoácidos parcial nos permitiu sugerir que a atividade de tripsina é codificada pela sequência AAEL005607. A tripsina purificada (AAEL005607) exibiu um valor de Km de 36,4 μM para o substrato Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa e foi fortemente inibida por AaTI e HiTI, ambos inibidores de tripsina, com valores de Ki de 0,94 pM e 160 pM, respectivamente. Em conclusão, pela primeira vez, a enzima digestiva majoritária de 4º instar larval de Ae. aegypti foi purificada e caracterizada.
Palavra-chave Enzimas digestivas
Inibidores de serinoproteases
Mosquitos
Tripsina
Larva
Trypsin-like enzymes
Aedes aegypti
Serina proteases
Culicidae
Enzimas
Larva
Enzymes
Aedes
Idioma Português
Data de publicação 2009-07-29
Publicado em SOARES, Tatiane Sanches. Estudos moleculares de enzimas do tipo tripsina presentes no intestino médio de larvas de Aedes aegypti. 2009. 106 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2009.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 106 p.
Direito de acesso Acesso aberto Open Access
Tipo Dissertação de mestrado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9600

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Nome: Publico-128.pdf
Tamanho: 1.182MB
Formato: PDF
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