Composição de Microdomínios de Membrana de Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum: Importância na infectividade de macrófagos alveolares

Composição de Microdomínios de Membrana de Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum: Importância na infectividade de macrófagos alveolares

Título alternativo Membrane Microdomains composition of Paracoccidioides brasiliensis and Histoplasma capsulatum: Importance on alveolar macrophage infectivity
Autor Tagliari, Loriane Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Takahashi, Helio Kiyoshi Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Ciências biológicas (biologia molecular) - São Paulo
Resumo Biological membranes are constituted by a mixture of several classes of lipids. In this enviroment, sphingolipids and sterols pack tightly to form together with specific proteins a complex membrane organization known as membrane microdomains. In order to detect the presence of membrane microdomains in yeast forms of pathogenic fungi, such as Paracoccidioides brasiliensis and Histoplasma capsulatum, yeast forms of both fungi were lysed by vortexing with glass beads and then incubated with Brij 98 at 4ºC. Fractions containing membrane microdomains were isolated by ultracentrifugation on sucrose gradient, and their components were analyzed by HPTLC, SDSPAGE and Western blotting. Analysis of membrane lipids showed that about 40% of ergosterol from both P. brasiliensis and H. capsulatum was present in the membrane microdomains, whereas the percentage of glycosphingolipids present in P. brasiliensis and H. capsulatum was 42% and 25%, respectively. Analysis by SDS-PAGE and Western blotting clearly showed a protein enrichment in the membrane microdomains fraction of both fungi. It is noteworthy the presence of Pma1p, a fungal microdomain marker, and also the presence of a 30 kDa (glyco)protein which binds to laminin. To investigate the requirement of ergosterol to mantain the integrity of membrane microdomains, it was used methylbeta- cyclodextrin (mβCD) an agent able to efficiently extract membrane sterols. After treatment of yeasts using mβCD, it was observed the removal of 80% and 70% of ergosterol in P. brasiliensis and H. capsulatum, respectively. After treatment with mβCD it was observed a shift of 25% of the glycosphingolipids from the insoluble to the soluble fraction, conversely the distribution profile of phospholipids remained unmodified after treatment with mβCD. The protein analysis showed the displacement of a few proteins to soluble fractions of the sucrose gradient, such as Pma1p and the (glyco)protein of 30 kDa. On the other hand, using an anti-α5-integrin antibody it was detected, even after the mβCD treatment, the presence of a 50 kDa protein in membrane microdomains, suggesting the existence of microdomains that do not depend on ergosterol for their integrity. These data strongly suggest the existence of two population of microdomains: i) dependent of ergosterol for integrity maintenance of microdomains and ii) microdomains non-dependent of ergosterol for the maintenance of their functional role. Furthermore, the biological importance of membrane microdomains was clearly demonstrated by a 53% reduction of infectivity of alveolar macrophage infectivity when yeast forms of H. capsulatum were treated with mβCD.

As membranas biológicas são formadas por uma mistura de várias classes de lipídeos, cujo empacotamento preferencial entre esfingolipídeos e esteróis formam junto com proteínas específicas, esta complexa organização conhecida como microdomínios de membrana. Com o intuito de verificar a presença de microdomínios de membrana em leveduras de fungos patogênicos como Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum, as leveduras desses dois fungos foram lisadas com pérolas de vidro e incubadas com Brij 98 a 4°C. As frações de microdomínios de membrana foram separadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose e, seus componentes analisados por HPTLC, SDS-PAGE e “Western blotting”. As análises dos lipídeos de membrana mostram que aproximadamente 40% do ergosterol das duas espécies de leveduras analisadas estão presentes nos microdomínios de membrana. Enquanto as porcentagens de glicoesfingolipídeos presentes nessas frações correspondem a 42% e 25%, em leveduras de P. brasiliensis e H. capsulatum, respectivamente. Em conjunto com as análises lipídicas, verificou-se nas duas espécies, um enriquecimento protéico nas frações de microdomínios de membrana, entre estas proteínas podemos citar a Pma1p, uma proteína marcadora de microdomínios de fungos, e uma proteína de 30 kDa, capaz de se ligar a laminina. Para determinar a importância do ergosterol na manutenção da integridade dos microdomínios de membrana utilizou-se metil-beta-ciclodextrina (mβCD), que é capaz de complexar e retirar o ergosterol. Após o tratamento das leveduras com mβCD verificou-se a extração dos esteróis numa proporção de 80% e 70% para P. brasiliensis e H. capsulatum, respectivamente. No entanto, o perfil de distribuição dos glicoesfingolipídeos e fosfolipídeos, analisados por HPTLC, não apresentou mudanças significativas após o tratamento com a mβCD. As análises protéicas demonstraram o deslocamento de algumas proteínas para frações solúveis do gradiente de sacarose como Pma1p e uma proteína de 30 kDa. Por outro lado, a marcação com o anticorpo anti-α5-integrina mostra a presença de uma proteína de 50 kDa nos microdomínios de membrana, mesmo após o tratamento com a mβCD, sugerindo a existência de uma população de microdomínios de membrana que não depende do ergosterol para manutenção de sua integridade. A importância desses microdomínios de membrana foi testada na infectividade de macrófagos alveolares, onde uma redução de 53% na infectividade de macrófagos foi verificada após o tratamento das leveduras de H. capsulatum com mβCD. Os resultados apresentados nessa tese demonstram a existência de microdomínios de membrana em leveduras de P. brasiliensis e H. capsulatum, bem como sua importância para a interação levedura-macrófago.
Palavra-chave Microdomínios da membrana
Paracoccidioides
Histoplasma
Ergosterol
Interações Hospedeiro-Parasita
Membrane Microdomains
Paracoccidioides
Histoplasma
Ergosterol
Host-Parasite Interactions
Idioma Português
Data de publicação 2009-03-25
Publicado em TAGLIARI, Loriane. Composição de Microdomínios de Membrana de Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum: Importância na infectividade de macrófagos alveolares. 2009. 192 f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2009.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 192 f.
Direito de acesso Acesso aberto Open Access
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9233

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Nome: Publico-9233.pdf
Tamanho: 4.017MB
Formato: PDF
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