Comparação genotípica e fenotípica de diferentes isolados clínicos e ambientais de Rhodotorula spp

Comparação genotípica e fenotípica de diferentes isolados clínicos e ambientais de Rhodotorula spp

Título alternativo Genotypic and phenotypic comparisons among clinical and environmental isolates of Rhodotorula spp
Autor Nunes, Jorge Meneses Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Colombo, Arnaldo Lopes Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Resumo Introduction: Rhodotorula spp. are yeasts widely distributed in the environment and can colonize the human body at different anatomical locations. This emerging pathogen is capable of causing superficial and invasive infections in humans whereas bloodstream infection is the most commonly described in the literature. Mainly three species have been related to human infections: R. mucilaginosa, R. glutinis and R. minuta. Objectives: i) assess the prevalence of Rhodotorula species in clinical and environmental samples by sequencing the ITS region of rDNA; ii) Analysis of interspecific variations in the genus Rhodotorula by the use of Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD); iii) evaluate the accuracy of the commercial system ID32C in identifying species of the genus Rhodotorula; iv) analysis the capability of biofilm formation of Rhodotorula spp. and v) the susceptibility profile to five antifungal agents. Methods: we analyzed 51 isolates of clinical samples and 8 of environmental samples. All isolates were identified by sequencing the ITS region of rDNA and subjected to RAPD using different primers for analysis of interspecific variability between these isolates. The clinical isolates were still subjected to phenotypic identification using the commercial system ID32C, the macro e and micromorphology analysis and nitrate assimilation. A crystal violet biofilm assay was carried out to assess the ability of biofilm formation of Rhodotorula spp. Finally, the broth microdilution method was performed to evaluate the susceptibility profile of these isolates to amphotericin B, caspofungin, fluconazole, voriconazole and posaconazole. Results: Through the sequencing of the ITS region of rDNA we observed that R. mucilaginosa was the most prevalent species among clinical isolates (86.3%), followed by R. minuta, R. dairenensis, Rhodosporidium diobovatum and Rhodosporidium fluviale, and it was also the most prevalent among environmental isolates (87.5%). RAPD using primer B14 were able to discriminate among species of the genus Rhodotorula and Rhodosporidium and showed increased discriminatory power compared to primer M2. The phenotypic identification using the commercial system ID32C with supplementary tests were concordant with sequencing of ITS region to identify 90.2% of clinical isolates. However, the accuracy of identification was low for 78.4% of these isolates. Regarding testing biofilm formation, 67.8% of the isolates were capable to form biofilm whereas only isolates of R. mucilaginosa and R. minuta presented this feature. It was also observed that the storage time of samples did not affect the ability of R. mucilaginosa biofilm formation (p = 0.927) and that clinical isolates of this species tended to form more biofilm than the environmental isolates (p = 0.074). All clinical Rhodotorula spp. isolates showed in vitro resistance to fluconazole (MIC ≥ 64 μg/ml) and caspofungin (MIC ≥ 4 μg/ml). In contrast, all clinical Rhodotorula spp. isolates were susceptible to amphotericin B (MIC ≤ 1 μg/ml), 86.6% were susceptible to voriconazole and 84.1% to posaconazole (MIC of both were ≤ 2 μg/ml). Conclusions: Molecular methods are appropriate and necessary for the accurate identification of Rhodotorula species whereas RAPD may be useful as screening tool for identifying pathogenic species of this genus. Considering that the clinical isolates of Rhodotorula spp. tended to an increased biofilm formation compared to environmental isolates and that the clinical relevant species R. mucilaginosa and R. minuta were the only ones with the ability to form biofilm, we can suggest that this feature has potential role in the virulence and pathogenesis of these species. The in vitro susceptibility testing suggests that amphotericin B and the new triazoles are the best therapeutic options against infections caused by Rhodotorula species.

Introdução: Rhodotorula spp. um fungo leveduriforme amplamente distribu do no ambiente e que pode colonizar o corpo humano em diferentes s tios anat micos. Este pat geno emergente tem a capacidade de causar infec es superficiais e invasivas em humanos, sendo a infec o de corrente sangu nea a forma mais comumente descrita na literatura. Principalmente tr s esp cies t m sido relacionadas a infec es em humanos: R. mucilaginosa, R. glutinis e R. minuta. Objetivos: i) avaliar a preval ncia de esp cies de Rhodotorula em amostras cl nicas e ambientais por meio de sequenciamento da regi o ITS do rDNA; ii) avaliar o poder discriminat rio interespec fico do m todo RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) na diferencia o dessas esp cies; iii) avaliar a acur cia do m todo comercial ID32C na identifica o de esp cies de Rhodotorula; iv) analisar a capacidade de forma o de biofilme desses isolados e v) o perfil de susceptibilidade a cinco antif ngicos. Material e métodos: Foram analisados 51 isolados cl nicos e 8 ambientais de Rhodotorula spp. Todos os isolados foram submetidos identifica o molecular por sequenciamento da regi o ITS do rDNA. Em seguida, foi empregada a t cnica de RAPD utilizando-se diferentes primers para an lise da variabilidade interespec fica entre esses isolados. Os isolados cl nicos foram submetidos ainda identifica o fenot pica pelo m todo comercial ID32C, an lise da macro e micromorfologia e da assimila o de nitrato. A avalia o da capacidade de forma o de biofilme das esp cies de Rhodotorula foi realizada pelo m todo de colora o por cristal violeta. Por fim, foi empregado o m todo de microdilui o em caldo para avalia o do perfil de susceptibilidade desses isolados anfotericina B, caspofungina, fluconazol, voriconazol e posaconazol. Resultados: Por meio do sequenciamento da regi o ITS do rDNA foi poss vel observar que a esp cie R. mucilaginosa foi a mais prevalente entre os isolados cl nicos (86,3%), seguida de R. minuta, R. dairenensis, Rhodosporidium diobovatum e Rhodosporidium fluviale, e a mais prevalente em amostras ambientais (87,5%). O m todo de RAPD com o primer B14 discriminou esp cies de Rhodotorula e Rhodosporidium, apresentando maior poder discriminat rio interespec fico em compara o com o primer M2. A identifica o fenot pica utilizando-se o m todo ID32C com a realiza o de testes complementares foi concordante com o m todo molecular na identifica o de 90,2% dos isolados cl nicos. Entretanto, a percentagem de identifica o foi baixa para 78,4% desses isolados. Em rela o aos ensaios de forma o de biofilme, 67,8% dos isolados foram classificados como formadores de biofilme, sendo que apenas os isolados de R. mucilaginosa e R. minuta apresentaram tal caracter stica. Foi observado ainda que o per odo de armazenamento das amostras n o interferiu na capacidade de forma o de biofilme dos isolados de R. mucilaginosa (p=0,927) e que os isolados cl nicos desta esp cie apresentaram uma tend ncia a formar mais biofilme do que os isolados ambientais (p=0,074). Todos os isolados cl nicos apresentaram resist ncia in vitro ao fluconazol (CIM ≥ 64 μg/ml) e caspofungina (CIM ≥ 4 μg/ml). Entretanto, todos os isolados foram suscept veis anfotericina B (CIM ≤ 1 μg/ml), 86,6% foram suscept veis ao voriconazol e 84,1% suscept veis ao posaconazol (CIM ≤ 2 μg/ml para ambos). Conclusões: M todos moleculares s o necess rios e adequados para a identifica o acurada de esp cies de Rhodotorula, sendo que o m todo RAPD pode ser uma ferramenta til como screening para a identifica o de esp cies patog nicas deste g nero. Considerando que os isolados cl nicos de Rhodotorula spp. apresentaram uma tend ncia a formar mais biofilme do que os isolados ambientais, e que as esp cies de interesse cl nico R. mucilaginosa e R. minuta foram as nicas que apresentaram capacidade de forma o de biofilme, pode-se sugerir que essa caracter stica apresenta potencial import ncia como fator de virul ncia e patogenicidade dessas esp cies. Os testes de susceptibilidade in vitro sugerem que anfotericina B e triaz licos de 2 gera o sejam as melhores op es terap uticas frente a infec es por Rhodotorula spp.
Palavra-chave Biofilmes
Técnica de amplificação ao acaso de DNA polimórfico
Susceptibilidade aos antifúngicos
Rhodotorula
Antifúngicos
Fenótipo
Genótipo
Idioma Português
Data de publicação 2011-08-31
Publicado em NUNES, Jorge Meneses. Comparação genotípica e fenotípica de diferentes isolados clínicos e ambientais de Rhodotorula spp. 2011. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2011.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 147 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Dissertação de mestrado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9222

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Nome: Retido-12725.pdf
Tamanho: 1.573MB
Formato: PDF
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