Clonagem, caracterização e expressão heteróloga de uma calnexina homóloga do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis

Clonagem, caracterização e expressão heteróloga de uma calnexina homóloga do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis

Título alternativo Cloning, characterization and heterologue expression of a calnexin homologue from the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis
Autor Feitosa, Luciano dos Santos Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Lopes, Jose Daniel Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Resumo We report the cloning of a Paracoccidioides brasiliensis cDNA, here named PbCnx, encoding the homologue of the endoplasmic reticulum calnexin. This chaperone specifically recognizes monoglucosylated glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Thus, it is an essential component of the folding process of nascent secreted glycoproteins. PbCnx open reading frame was found in a 1,701-base pair fragment that encodes a 567-residue amino acids protein with estimated mass of 62,680 Da. The deduced amino acid sequence shares identity with the described sequences of calnexin from Aspergillus fumigatus and Aspergillus niger. It also shows twenty potential phosphorylation sites and two potential N-glycosylation sites. Moreover, this amino acid sequence showed a remarkable degree of conservation, especially in the central portion named highly conserved central domain (hcd) that contains, as a hallmark, KPEDWD-repeats. These repeats represent a high-affinity calcium-binding site and are found in all members of the calnexin/calreticulin family proteins. Northern and Southern blots hybridizations analysis showed that PbCnx is encoded by a single or low number of copies genes. A cDNA encoding PbCnx was overexpressed as recombinant protein in Escherichia coli. The purified recombinant PbCnx was recognized by sera of Paracoccidiomycosis patients (chronic form). The monoespecific polyclonal serum generated against the recombinant calnexin allowed it’s cellular localization by confocal microscopy. The staining pattern observed by immunofluorescence showed this protein intensely distributed in the cytoplasmic region. Furthermore, these polyclonal serum specifically recognized native calnexin on P. brasiliensis yeast form cellular extract by immunoblotting.

Descrevemos neste trabalho a clonagem do cDNA de, que codifica uma calnexina homóloga do retículo endoplasmático de Paracoccdiioides brasiliensis. Esta chaperone reconhece especificamente glicoproteínas monoglicosiladas no retículo endoplasmático, sendo assim um componente essencial para o processo de dobramento de glicoproteínas nascentes que serão secretadas. A fase aberta de leitura da PbCnx foi encontrada num fragmento de 1.701 pares de bases (pb) que codifica uma proteína de 567 resíduos de aminoácidos, com massa estimada em 62.680 Da. A seqüência deduzida de aminoácidos compartilha identidade com as sequências descritas das calnexinas de Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger e apresenta vinte potenciais sítios de fosforilação e dois de glicosilação. Além disso, esta seqüência deduzida de aminoácidos apresenta um extraordinário grau de conservação, especialmente numa região central, denominada domínio central altamente conservado (hcd) que contém, como uma ‘marca’, sequências repetidas KPEDWD; estas sequências são consideradas sítios ligantes de cálcio de alta afinidade e são encontradas em todos os membros da família das calnexinas e calreticulinas. A análise das hibridações por Southern e Northern blots, mostraram que a proteína é codificada por um único gene ou gene de poucas cópias. O cDNA que codifica PbCnx foi expresso como proteína recombinante em Escherichia coli. A proteína recombinante purificada foi reconhecida por soros de paciente com paracoccidioidomicose (forma crônica). Foi gerado também um soro policlonal monoespecífico, a partir da proteína recombinante de fusão, utilizado para a localização celular da proteína, através de microscopia confocal. O padrão de marcação observado por imunofluorescência mostra a proteína intensamente distribuída na região citosólica da célula. Além disso, este soro policlonal reconheceu especificamente a calnexina nativa através de ensaios de immunoblotting do extrato total de células leveduriformes de P. brasiliensis.
Palavra-chave Chaperonas moleculares
Calnexina
Proteína recombinante
Paracoccidioides brasiliensis
Idioma Português
Data de publicação 2006-01-01
Publicado em FEITOSA, Luciano dos Santos. Clonagem, caracterização e expressão heteróloga de uma calnexina homóloga do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis. 2006. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2006.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 130 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9204

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