Caracterização, clonagem e expressão de um inibidor de elastase de neutrófilo humano, purificado de sementes de Caesalpinia echinata (paubrasil)

Caracterização, clonagem e expressão de um inibidor de elastase de neutrófilo humano, purificado de sementes de Caesalpinia echinata (paubrasil)

Título alternativo Characterization, cloning and expression of a human neutrophil elastase inhibitor, purified from Caesalpinia echinata (pau-brasil) seeds
Autor Cruz-Silva, Ilana Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Araujo, Mariana da Silva Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Resumo Proteases are enzymes involved in several biological processes such as vasoactive peptides release, blood coagulation, fibrinolysis and complement cascade, and are related to serious pathological processes. Elastase is one of the most destructive enzymes in the body, and without control by endogenous inhibitors, this enzyme may cause damages, as pulmonary edema. As the known inhibitors are harmful due to secondary effects, the search for new elastase inhibitors is justified. Protease Inhibitors are essential to life maintenance and, in plants, the leguminous have an enormous quantity of these proteins in seeds, fruits and roots. The aims of the present study were: (i) to purify and characterize a human neutrophil elastase inhibitor from C. echinata; (ii) to clone the cDNA of the inhibitor; (iii) to express and purify the recombinant inhibitor. Our group has worked in the isolation and characterization of different enzymes and inhibitors from Caesalpinia echinata (brazil wood) seeds. After homogenization of ground peeled seeds in saline solution, acetone fractionation, ion-exchange (Resource Q) chromatography, gel filtration (Superdex G- 200) and reverse phase (C-18) chromatography, the one chain 23 kDa Kunitz-type elastase inhibitor was obtained (CeEI). This protein presented high inhibitory activity to human neutrophil elastase (Ki = 1.9 nM) and decreased both pulmonary artery pressure and edema formation in an experimental model using rabbit isolated lungs. The CeEI gene was cloned by RT-PCR using RNAm prepared by premature seeds. PCR amplified DNA fragment (700 bp) using a degenerated oligonucleotide based on the CeEI N-terminal amino acid sequence was ligated into the pGEM-T easy vector and sequenced. The translated amino acid sequence of two clones presented two putative Kunitz type serine protease inhibitors. The genes were sub-cloned into pET-14b vector (the protein is fused to a His-Tag) and the recombinant proteins expressed by E. coli Rosetta Gami. The recombinant proteins were purified by affinity (Ni-Sepharose) and ion-exchange (Hi-Trap Q) chromatographies. The two purified proteins presented dissociation constants for human neutrophil elastase (Ki = 0.7 nM) and chymotrypsin (Ki of 145 and 31.2 nM). The comparison of the CeEI amino acid sequences with others confirmed these proteins as Kunitz-type soybean trypsin inhibitor.

As proteases são enzimas que participam de diversos processos biológicos, como a liberação de peptídeos biologicamente ativos, a coagulação sangüínea, a fibrinólise e a cascata do complemento, mas também de processos patológicos, como a doença de Alzheimer, artrite e edema. Dentre essas enzimas, a elastase é uma das mais destrutivas do corpo, e quando não controlada por seus inibidores endógenos, pode causar danos irreversíveis. No edema pulmonar, os inibidores endógenos de elastase são incapazes de regular sozinhos a ação da enzima. E como os vários inibidores exógenos utilizados no tratamento desta patologia têm apresentado diversos efeitos colaterais, é justificada a pesquisa de novos inibidores de elastase que não apresentem estes efeitos. Por serem essenciais à vida, os inibidores são encontrados em todos os organismos. Dentre as plantas, as leguminosas são as que apresentam grandes quantidades de inibidores em sementes, frutos e raízes. O nosso laboratório vem isolando e caracterizando diferentes enzimas e inibidores de Caesalpinia echinata (pau-brasil), uma leguminosa muito importante na história do Brasil, e os objetivos desse trabalho foram: caracterizar um inibidor de elastase de neutrófilo humano extraído das sementes dessa planta, clonar o gene que codifica este inibidor e expressar o inibidor recombinante. As sementes descascadas foram trituradas e homogeneizadas em uma solução salina. Após fracionamento por acetona, cromatografia de troca iônica, filtração em gel e cromatografia de fase reversa, obteve-se um inibidor do tipo Kunitz, de cadeia única, de aproximadamente 23 kDa, capaz de inibir elastase de neutrófilo humano (Ki=1,9 nM) e diminuir a pressão da artéria pulmonar e a formação de edema em um modelo experimental em coelho. O fragmento de cDNA de CeEI, de aproximadamente 700 pb, foi clonado a partir de RNAm de sementes imaturas de C. echinata. Nelas constatou-se a presença de mais de um gene codificante para inibidor de elastase; porém, ambas as proteínas recombinantes apresentaram seqüências e constantes de inibição para elastase de neutrófilo humano e quimotripsina semelhantes, sugerindo que possa existir mais de uma isoforma desse inibidor nesta planta. Nos últimos anos, técnicas em Biologia Molecular, como a clonagem de proteínas e as mutações dirigidas, proporcionaram uma vasta ampliação no conhecimento de inibidores de proteases. As ferramentas geradas nesse trabalho poderão ser utilizadas na geração de novos inibidores mais específicos, por meio de mutações dirigidas no sítio reativo, para aplicações práticas não só na Medicina, mas também na Agricultura.
Palavra-chave Caesalpinia echinata (pau-brasil)
Inibidores de proteases
Edema pulmonar
Clonagem
Elastase pancreática
Protease inhibitors
Pulmonary edema
Pancreatic elastase
Caesalpinia
Idioma Português
Data de publicação 2006-12-31
Publicado em SILVA, Ilana Cruz. Caracterização, clonagem e expressão de um inibidor de elastase de neutrófilo humano, purificado de sementes de Caesalpinia echinata (paubrasil). 2006. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2006.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 134 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Dissertação de mestrado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9194

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