BmCistatina, Inibidor de cisteinoproteases presente em corpo gorduroso de carrapato Boophilus microplus: Clonagem, expressão, purificação e caracterização

BmCistatina, Inibidor de cisteinoproteases presente em corpo gorduroso de carrapato Boophilus microplus: Clonagem, expressão, purificação e caracterização

Título alternativo Bmcystatin, cysteine protease inhibitor present in fat body of Boophilus microplus tick: Cloning, expression, purification and characterization
Autor Lima, Cássia Arantes de Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Nader, Helena Bonciani Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Resumo The tick economic importance is directly related to its blood feeding behavior. Among the species that belong to the Ixodidae family the Boophilus microplus tick has great importance in veterinary medicine. It is an ectoparasite responsible for disease transmissions such as: the babesiosis and fever of cattle. The tick control has been done by using acaricides, however alternative methods as the immunological control have been investigated. The protease inhibitors have an important role in the proteolysis regulation of endogenous or exogenous enzymes from all organisms. The protease inhibitors present in hematophagous animals are important molecules in the control of innumerous proteases involved in the host’s hemostatic and immune systems. The present work describes the characterization of a recombinant cysteine protease inhibitor, Bmcystatin from the fat body of B. microplus. The complete nucleotide sequence of the Bmcystatin (298 pb) was obtained by random sequencing of clones from a fat body cDNA library. The recombinant protein was produced using the E. coli BL21 SI expression vector pET26b. The Bmcystatin expression was induced with 0.3 M NaCl and the soluble protein extracted by French press. The Bmcystatin purification was performed by affinity chromatography on Ni-NTA agarose resin followed by ionic exchange chromatography on HiTrap Q column. Purified Bmcystatin presented molecular mass of 11 kDa and high inhibitory activity for cathepsin L with Ki value of 0.1 nM. The Bmcystatin amino acid sequence presented 70% similarity to an Ixodes scapularis tick cystatin. The expression analysis of Bmcystatin by semiquantitive RT-PCR showed DNA band amplification only in the fat body cDNA preparation. On the other hand, the protein recognition by anti-Bmcystatin antibody was observed in the fat body and salivary gland extracts of B. microplus by Western blot. In conclusion, this work generated the following tools for future studies: the anti-Bmcystatin antibody and the complete nucleotide sequence of Bmcystatin gene, which will be important to confirm Bmcystatin localization in B. microplus, and it will allow us to use the RNA interference methodology for functional studies, respectively.

A importância econômica dos carrapatos está relacionada a seus hábitos hematofágicos. Entre as espécies que pertencem à família Ixodidae, o carrapato Boophilus microplus tem grande importância veterinária por ser vetor de patógenos, atuando como ectoparasito em animais domésticos e silvestres, transmitindo a doença conhecida como o babesiosis e febre do gado. O método de controle convencional tem sido o uso de acaricidas; no entanto, formas alternativas como o controle imunológico, estão sendo investigadas. Os inibidores de proteases têm um papel fundamental na regulação da proteólise, sendo as enzimas alvo de origem endógena ou exógena, permitindo a regulação da velocidade de proteólise. Estes inibidores são moléculas produzidas por hematófagos que merecem destaque, visto a necessidade de controle das inúmeras proteases envolvidas no sistema hemostático e imune do hospedeiro. Cistatinas são inibidores naturais de cisteinoprotease (família C1) do tipo papaína e estão envolvidas em processos fisiológicos como processamento de antígeno, resposta imunomodulatória, diferenciação celular, e também em processos patológicos como metástase e inflamação. O presente trabalho descreve a caracterização da Bmcistatina recombinante isolada do corpo gorduroso do B. microplus. A seqüência completa de nucleotídeos da Bmcistatina (298 pb) foi obtida através do sequenciamento de nucleotídeos de clones aleatórios de uma biblioteca de cDNA de corpo gorduroso. A proteína recombinante foi produzida utilizando o vetor de expressão pET26b e a cepa E. coli BL21 SI. A Bmcistatina foi induzida com 0,3 M de NaCl e extraída por French press na forma solúvel. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA agarose seguida de cromatografia de troca iônica HiTrap Q. Bmcistatina apresentou massa molecular de 11 kDa, e forte atividade inibitória para catepsina L com Ki de 0,1 nM. A seqüência de aminoácidos apresentou 70% de similaridade com uma cistatina de carrapato Ixodes scapularis. A análise da expressão gênica de Bmcistatina por PCR semiquantativo mostrou amplificação de banda apenas em preparação de cDNA de corpo gorduroso; por outro lado, a presença de proteínas de tamanhos similares reconhecidas pelo anticorpo anti-Bmcistatina foi observada em extratos de corpo gorduroso e glândulas salivares de B. microplus utilizando experimento de Western blot. Com o intuito de entender a função da Bmcistatina, esse trabalho gerou ferramentas como o anticorpo anti- Bmcistatina e a seqüência do gene de Bmcistatina, que serão importantes para a confirmação da localização dessa proteína nesse ectoparasito e permitirão também a utilização da metodologia de interferência de RNA em estudos funcionais futuros.
Palavra-chave Boophilus microplus
hematófago
inibidores
cistatina
cisteinoproteases
estefinas
Idioma Português
Data de publicação 2006-12-31
Publicado em LIMA, Cassia Arantes de. BmCistatina, Inibidor de cisteinoproteases presente em corpo gorduroso de carrapato Boophilus microplus: Clonagem, expressão, purificação e caracterização. 2006. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2006.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Dissertação de mestrado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9149

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Nome: Restrito-0097.pdf
Tamanho: 1.923MB
Formato: PDF
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