Gene transfer to primary corneal epithelial cells with an integrating lentiviral vector

Gene transfer to primary corneal epithelial cells with an integrating lentiviral vector

Título alternativo Transferência de genes heterólogos para células corneanas epiteliais primárias utilizando vetor lentivírus
Autor Oliveira, Lauro Augusto De Autor UNIFESP Google Scholar
Kim, Charles Google Scholar
Sousa, Luciene Barbosa De Autor UNIFESP Google Scholar
Schwab, Ivan R. Google Scholar
Rosenblatt, Mark I. Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
University of California Department of Ophthalmology and Visual Science
Weill Cornell Medical College Department of Ophthalmology
Resumo PURPOSE: To evaluate the transfer of heterologous genes carrying a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter cassette to primary corneal epithelial cells ex vivo. METHODS: Freshly enucleated rabbit corneoscleral tissue was used to obtain corneal epithelial cell suspension via enzymatic digestion. Cells were plated at a density of 5×10³ cells/cm² and allowed to grow for 5 days (to 70-80% confluency) prior to transduction. Gene transfer was monitored using fluorescence microscopy and fluorescence activated cell sorter (FACS). We evaluated the transduction efficiency (TE) over time and the dose-response effect of different lentiviral particles. One set of cells were dual sorted by fluorescence activated cell sorter for green fluorescent protein expression as well as Hoechst dye exclusion to evaluate the transduction of potentially corneal epithelial stem cells (side-population phenotypic cells). RESULTS: Green fluorescent protein expressing lentiviral vectors were able to effectively transduce rabbit primary epithelial cells cultured ex vivo. Live cell imaging post-transduction demonstrated GFP-positive cells with normal epithelial cell morphology and growth. The transduction efficiency over time was higher at the 5th post-transduction day (14.1%) and tended to stabilize after the 8th day. The number of transduced cells was dose-dependent, and at the highest lentivirus concentrations approached 7%. When double sorted by fluorescence activated cell sorter to isolate both green fluorescent protein positive and side population cells, transduced side population cells were identified. CONCLUSIONS: Lentiviral vectors can effectively transfer heterologous genes to primary corneal epithelial cells expanded ex vivo. Genes were stably expressed over time, transferred in a dose-dependence fashion, and could be transferred to mature corneal cells as well as presumable putative stem cells.

OBJETIVO: Avaliar a transferência de genes heterólogos expressando a proteí­na Green Fluorescent Protein (GFP) para células corneanas epiteliais primárias ex vivo utilizando vetor lentivírus. MÉTODOS: Tecido corneoescleral de coelhos foi usado para obtenção de suspensão de células corneanas epitelias. As células foram semeadas na densidade de 5×10³ células/cm² e expandidas por 5 dias até uma confluência de 70-80% antes de serem transduzidas. A transferência genética foi monitorada por microscopia fluorescente e por um separador de células ativadas por fluorescência. Foram avaliadas a eficiência de transdução ao longo do tempo e o efeito dose-resposta de diferentes quantidades de partículas virais. Um grupo de células foi analisado pelo separador de células ativadas por fluorescência para avaliar a transdução de células com fenótipo de cé­lulas tronco do epitélio corneano (baseado na exclusão do corante Hoechst dye). RESULTADOS: Os vetores lentivírus foram efetivos na transdução de cé­lulas corneanas epiteliais primárias de coelhos ex vivo. Fotodocumentação das células vivas demonstrou células epiteliais de morfologia normal e expressando o gene fluorescente (GFP). A eficiência de transdução ao longo do tempo foi maior no quinto dia após a transdução (14,1%) e demonstrou uma tendência à estabilidade a partir do oitavo dia após a transdução. O número de células transduzidas foi dose-dependente e atingiu 7% com as maiores concentrações de partículas virais. Quando analisadas pelo separador de células ativadas por fluorescência para detecção de células transduzidas e também de células que excluíram o corante Hoechst dye, foi detectado que células com fenótipo de células tronco do epitélio corneano (side-population) também foram transduzidas. CONCLUSÕES: Os vetores lentivirais podem transferir genes heterolólogos para células corneanas epiteliais primárias expandidas ex vivo de forma eficiente. Os genes foram expressos de forma estável ao longo do tempo e puderam ser transferidos tanto para células epiteliais maduras como para presumíveis células tronco epiteliais. A eficiência de transdução foi obtida de forma dose-dependente.
Palavra-chave Gene therapy
Corneal diseases
Lentivirus
Transgenes
Stem cells
Epithelium corneal
Gene expression
Terapia de genes
Doenças da córnea
Lentivírus
Trangenes
Células tronco
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Expressão gênica
Idioma Inglês
Data de publicação 2010-10-01
Publicado em Arquivos Brasileiros de Oftalmologia. Conselho Brasileiro de Oftalmologia, v. 73, n. 5, p. 447-453, 2010.
ISSN 0004-2749 (Sherpa/Romeo)
Publicador Conselho Brasileiro de Oftalmologia
Extensão 447-453
Fonte http://dx.doi.org/10.1590/S0004-27492010000500012
Direito de acesso Acesso aberto Open Access
Tipo Artigo
SciELO S0004-27492010000500012 (estatísticas na SciELO)
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/5984

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Nome: S0004-27492010000500012.pdf
Tamanho: 1.450MB
Formato: PDF
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