Nanopartículas de sílica mesoporosa quimicamente modificadas para transfecção com DNA plasmidial

Nanopartículas de sílica mesoporosa quimicamente modificadas para transfecção com DNA plasmidial

Author Caprina, Laura Cipriano Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Bizeto, Marcos Augusto Autor UNIFESP Google Scholar
Graduate program Ciência e Tecnologia da Sustentabilidade
Abstract A terapia gênica regula a expressão de um gene terapêutico pela transferência de ácidos nucleicos para o interior das células alvo. No entanto, os ácidos nucleicos por si só apresentam dificuldades em penetrar a membrana celular, necessitando de vetores para realizar tal entrega. Vírus de replicação incompetente são vetores que possibilitam a expressão transiente ou permanente de genes com alta eficiência, porém apresentam riscos relacionados à biossegurança e alto custo de produção. Em contrapartida, os vetores não virais são mais seguros e baratos de produzir, mas ainda ineficientes. Nesse contexto, nanopartículas de sílica mesoporosa (NPSM) têm sido consideradas como uma das plataformas promissoras para a entrega de vetores não virais por possuírem propriedades singulares, como: grande área superficial, extensa rede de poros de tamanhos ajustáveis, propriedades químicas de superfície de fácil modificação, além de biocompatibilidade e degradabilidade. Neste estudo, as NPSM foram preparadas pela hidrólise básica do tetraetilortossilicato e posterior condensação na presença de direcionadores estruturais baseados em agregados micelares de um surfactante catiônico. Após a remoção do molde as nanopartículas foram modificadas com alquilaminossilanos, que continham na cadeia alquílica um, dois ou três grupos amino, para adquirir a capacidade de transportar DNA plasmidial (pDNA), sendo a eficiência de transfecção avaliada em diferentes linhagens celulares. As nanopartículas produzidas apresentaram, formato esférico, com diâmetro ao redor de 90 nm, grande área superficial (740 m2 /g), repleta de poros distribuídos em um arranjo não completamente ordenado ao longo da partícula. Dispersões aquosas foram analisadas por medidas de espalhamento dinâmico de luz e de potencial Zeta, que indicaram polidispesividade e nanopartículas com carga superficial positiva variando entre 12,5 e 29,5 mV. A capacidade de interação com pDNA foi comprovada através de eletroforese em gel de agarose, tendo as NPSM funcionalizadas com 2 e 3 grupos amino maior eficiência de complexação. A avaliação da citotoxicidade das NPSM-NxH2 e dos complexos foi realizada pelo ensaio de MTT usando células NIH3T3 e HeLa, respectivamente, e indicou uma viabilidade de cerca de 80% para as células NIH3T3 incubadas com as nanopartículas e ao redor de 50% para as células HeLa incubadas com os complexos. Os complexos pDNA:NPSMNxH2 foram capazes de transfectar células HEK293T e HeLa, mas não células NIH3T3 empregando condições experimentais similares. A citometria de fluxo, indicou taxas de transfecção em células HeLa de 5,7 ± 1,8 %, 3,8 ± 1,3 % e 2,3 ± 1,2 % para as NPSM modificadas com os grupos NH2, NNH2 e NNNH2, respectivamente, taxas essas que foram inferiores a de 18,0 ± 9,7 % conseguida com o controle positivo, Lipofectamina 2000. NPSM com poros carregados com cloroquina, um agente endossomolítico, foram utilizadas visando aumentar a eficiência de transfecção. No entanto, a taxa de transfecção continuou baixa (1,9 ± 1 %), indicando que o aprisionamento endossomal parece não ter sido a etapa limitante do processo de transfecção deste sistema de entrega.

Gene therapy regulates the expression of therapeutic genes through nucleic acids. However, naked nucleic acids have difficulties to penetrate cell membranes, requiring vectors to do so. Replication-incompetent viruses enable transient or permanent expression of genes with high efficiency, but are associated with risks related to biosafety and high cost. Otherwise, non-viral vectors are safer and cheaper to produce, but still inefficient. In this context, mesoporous silica nanoparticles (MSN) have been considered one of the promising platforms for delivery of non-viral vectors due to their singular properties, such as: large surface area, extensive porous structure with adjustable size, easy surface chemistry modification along with good biocompatibility and degradability. In this study, MSN were synthesized by basic hydrolysis of tetraethylorthosilicate and posterior condensation around structure-directing agents based on micellar aggregates of a cationic surfactant. After template removal, nanoparticles were modified with alkylsilanes containing one, two or three amino groups in their alkyl chains to allow plasmid DNA transport, which efficiency was evaluated in different cell lines. The synthesized nanoparticles were spherical shape, with diameter around 90 nm, large surface area (740 m2 /g), which was covered with pores distributed in a not completely ordered form throughout the particle. Dynamic light scattering and Zeta potential measurements of aqueous dispersions revealed polydispersivity and positive surface charge ranging from 12,5 to 29,5 mV. Their capacity to interact with pDNA was confirmed through agarose gel electrophoresis, where higher complexation efficiency was observed for nanoparticles modified with 2 or 3 amino groups. The cytotoxicity of MSN-NxH2 and its complexes was assessed through MTT assays with NIH3T3 and HeLa cells, respectively, and indicated about 80% of viability for NIH3T3 cells incubated with nanoparticles and 50% of viability for HeLa cells incubated with complexes. The complexes pDNA:MSN-NxH2 were able to transfect HEK293T and HeLa cells, but not NIH3T3 cells under similar experimental conditions. Flow cytometry revealed transfection efficiency of 5.7±1.8%, 3.8±1.3% and 2.3±1.2% for MSN modified with the NH2, NNH2 and NNNH2, respectively, in HeLa cells, those were inferior to 18±9.7% obtained by the positive control, Lipofectamine 2000. Nanoparticles with pores loaded with chloroquine, an endosomolitic agent, were tested aiming to increase transfection rates. However, the transfection rate remained low (1.9 ± 1%), indicating that endosomal entrapment may not be the limiting step of transfection with this delivery system.
Keywords Terapia gênica
Vetor não viral
Nanopartículas
Sílica mesoporosa
DNA plasmidial
Gene therapy
Non-viral vector
Nanoparticles
Mesoporous silica
Plasmid DNA
xmlui.dri2xhtml.METS-1.0.item-coverage Diadema
Language Portuguese
Sponsor Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Date 2019-04-10
Research area Desenvolvimento e Aplicações de Materiais Sustentáveis
Knowledge area Ciências da sustentabilidade
Publisher Universidade Federal de São Paulo
Extent 127 f.
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/57430

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Name: Dissertação - Laura Cipriano Crapina.pdf
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