The use of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) peptidesfor measurement of clinically important proteolytic enzymes

The use of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) peptidesfor measurement of clinically important proteolytic enzymes

Autor Carmona, Adriana Karaoglanovic Autor UNIFESP Google Scholar
Juliano, Maria Aparecida Autor UNIFESP Google Scholar
Juliano, Luiz Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Resumo Proteolytic enzymes have a fundamental role in many biological processes and are associated with multiple pathological conditions. Therefore, targeting these enzymes may be important for a better understanding of their function and development of therapeutic inhibitors. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) peptides are convenient tools for the study of peptidases specificity as they allow monitoring of the reaction on a continuous basis, providing a rapid method for the determination of enzymatic activity. Hydrolysis of a peptide bond between the donor/acceptor pair generates fluorescence that permits the measurement of the activity of nanomolar concentrations of the enzyme. The assays can be performed directly in a cuvette of the fluorimeter or adapted for determinations in a 96-well fluorescence plate reader. The synthesis of FRET peptides containing ortho-aminobenzoic acid (Abz) as fluorescent group and 2, 4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2, 4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp) as quencher was optimized by our group and became an important line of research at the Department of Biophysics of the Federal University of São Paulo. Recently, Abz/Dnp FRET peptide libraries were developed allowing high-throughput screening of peptidases substrate specificity. This review presents the consolidation of our research activities undertaken between 1993 and 2008 on the synthesis of peptides and study of peptidases specificities.

As enzimas proteolíticas têm um papel fundamental em muitos processos biológicos e estão associadas a vários estados patológicos. Por isso, o estudo da especificidade das peptidases pode ser importante para uma melhor compreensão da função destas enzimas e para o desenvolvimento de inibidores. Os substratos com supressão intramolecular de fluorescência constituem uma excelente ferramenta, pois permitem o monitoramento da reação de forma contínua, proporcionando um método prático e rápido para a determinação da atividade enzimática. A hidrólise de qualquer ligação da cadeia peptídica entre o grupo doador e o grupo supressor gera fluorescência que permite detectar concentração nanomolar de enzima. Os ensaios podem ser acompanhados diretamente na cubeta ou adaptados para determinações de fluorescência em leitoras de placa. A síntese dos peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência contendo o grupo fluorescente Abz (orto-aminobenzóico) e o grupo supressor EDDnp (N-[2, 4-dinitrofenil]-etilenodiamino ou Dnp (2, 4-dinitrophenyl) foi otimizada pelo nosso grupo e tornou-se uma importante linha de pesquisa no Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Recentemente, foram desenvolvidas bibliotecas de peptídeos fluorogênico contendo Abz/Dnp como grupo doador/supressor trazendo um grande avanço no estudo de especificidade das peptidases. Esta revisão apresenta o trabalho desenvolvido pelo nosso grupo entre 1993 e 2008 sobre a síntese de peptídeos e o estudo da especificidade de peptidases.
Palavra-chave continuous recording assay
fluorescence resonance energy transfer
FRET substrates
proteolytic enzymes
angiotensin I-converting enzyme
neprilisin
ensaios contínuos
substratos com supressão intramolecular de fluorescência
substratos fluorogênicos
enzimas proteolíticas
enzima conversora da angiotensina I
neprilisina
Idioma Inglês
Financiador Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Data de publicação 2009-09-01
Publicado em Anais da Academia Brasileira de Ciências. Academia Brasileira de Ciências, v. 81, n. 3, p. 381-392, 2009.
ISSN 0001-3765 (Sherpa/Romeo, fator de impacto)
Publicador Academia Brasileira de Ciências
Extensão 381-392
Fonte http://dx.doi.org/10.1590/S0001-37652009000300005
Direito de acesso Acesso aberto Open Access
Tipo Artigo
Web of Science WOS:000269462300005
SciELO S0001-37652009000300005 (estatísticas na SciELO)
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/5200

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Nome: S0001-37652009000300005.pdf
Tamanho: 763.8KB
Formato: PDF
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