Aspectos Genéticos E Da Dinâmica Da Interação De Escherichia Coli Enteropatogênica Atípica E E Albertti Com Células Epiteliais

Aspectos Genéticos E Da Dinâmica Da Interação De Escherichia Coli Enteropatogênica Atípica E E Albertti Com Células Epiteliais

Author Romao, Fabiano Teodoro Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Amaral, Tania Aparecida Tardelli Gomes Do Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Microbiologia E Imunologia
Abstract Atypical enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Escherichia albertii are recognized enteropathogens in several geographic regions. They produce the attaching-effacing (AE) lesions in enterocytes, whose formation depends on the expression of several genes located in the LEE (locus of enterocyte effacement) region, including those involved in the formation of a Type 3 Secretion System (SST3) and the adhesin intimin. The AE lesion formation requires the interaction of intimin and its receptor, Tir, which is translocated by the SST3. There are some gaps in the knowledge on how the LEE-genes are expressed during bacterial interaction with host cells. Objectives: To study two AE-producing pathogens, aEPEC 1711-4 and E. albertii 1551-2, regarding the expression of the five LEE operons during the various stages of their interaction with enterocytes (adhesion, invasion, and intracellular persistence), as well as the occurrence of alterations (quantitative and qualitative) in the bacterial interaction during these different phases. In addition, the genome of these strains was sequenced and analysed to verify the possible involvement of effector proteins and other potential virulence factors that could be associated to the process of invasion and intracellular persistence. Methods: Qualitative and quantitative alterations in adhesion, AE lesion production, invasion and intracellular persistence in polarized and differentiated Caco-2 intestinal cells were evaluated using a kinetic study (1.5 h, 3 h, 6 h and 24 h of interaction). RT-PCR was used to analyze and compare the expression of genes representative of the five LEE operons (ler, escC, escV, eae and espA) in these different periods of interaction. For aEPEC 1711-4, the expression of the fliC gene, which encodes the structural subunit of the flagellum, was also analyzed, since previously it had been demonstrated that this structure contributes to cell adhesion and invasion abilities of this strain. For the fluorescence actin polymerization assays, HeLa cells were used at 2 h, 3 h and 6 h times, and for Livecell imaging, GFP transformed cells were used for 2 h. Sequencing of aEPEC 1711-4 and E. albertii 1551-2 strains and secreted protein analysis were also performed for further analysis. Results: For both strains studied, the amount of bacteria adhered to Caco-2 cells increased up to 3 h of contact (approximately 105 CFU / mL), remaining constant between 3 h and 6 h. In addition, for both strains, the invasion process started close to 3 h of contact with these cells (0.2% of the total associated bacteria for aEPEC 1711-4 and 0.02% for E. albertii 1551-2). Expression of the eae gene (which encodes for intimin) in aEPEC 1711-4 progressively increased up to 6 h of contact, while the expression of the other genes representative of the LEE and fliC remained constant. In turn, for E. albertii 1551-2, there was no change in the expression of the genes studied within 6 h of interaction. During intracellular persistence, the expression of the studied genes remained constant in aEPEC 1711-4, while for E. albertii 1551-2, it was observed an increase of at least 8-fold in the expression of these genes. Genome analysis of strain 1551-2 identified the presence of 31 SST3-dependent effectors, among them a TccP2/EspFu2 variant. Conclusion: SST3 is associated with adhesion, colonization, invasion and intracellular persistence in the aEPEC and E. albertii strains studied, with the expression of each operon being distinct, indicating that other transcriptional and/or post-transcriptional regulators could contribute for the observed differences.

Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) e Escherichia albertii, reconhecidos enteropatógenos em diversas regiões geográficas, produzem lesão attaching-effacing (AE) em enterócitos. A formação da lesão depende da interação da adesina intimina e do seu receptor, Tir, que é translocado pelo Sistema de Secreção do Tipo 3. Os genes envolvidos na formação da lesão AE estão localizados na região LEE (locus of enterocyte effacement), mas existem algumas lacunas no conhecimento sobre como são expressos durante a interação com as células do hospedeiro. Objetivos: Estudar dois patógenos produtores de lesão AE, aEPEC 1711-4 e E. albertii 1551-2, com relação à expressão dos cinco operons da região LEE, nas diversas fases da interação com enterócitos (adesão, invasão e persistência intracelular), bem como a ocorrência de alterações (quantitativas e qualitativas) na interação bacteriana nessas diferentes fases. Além disso, pretendeuse analisar o genoma dessas cepas para se verificar o eventual envolvimento de proteínas efetoras e de outros potenciais fatores de virulência que poderiam estar associados ao processo de invasão e persistência intracelular. Métodos: Foram avaliadas as alterações qualitativas e quantitativas de adesão, produção de lesão AE, invasão e persistência intracelular em células intestinais Caco-2 polarizadas e diferenciadas, empregando-se um estudo cinético (1,5 h; 3 h; 6 h e 24 h de interação). RT-PCR foi empregado para analisar e comparar a expressão de genes representativos dos cinco operons da região LEE (ler, escC, escV, eae e espA), nesses diferentes períodos de interação. Para a aEPEC 1711-4, foi também analisada a expressão do gene fliC, que codifica a subunidade estrutural do flagelo, pois, anteriormente, havia sido demonstrado que essa estrutura contribui para adesão e invasão celular dessa cepa. Para os ensaios de polimerização de actina por fluorescência foram utilizadas células HeLa, nos tempos de 2 h, 3 h e 6 h, e para o livecell imaging foram utilizadas células HeLa transformadas com GFP durante 2 h. Foi também realizado o sequenciamento das cepas aEPEC 1711-4 e E. albertii 1551-2 e análise de proteínas secretadas para posterior análise. Resultados: Observou-se que, para ambas as cepas estudadas, a quantidade de bactérias aderidas sobre células Caco-2 aumentou até 3 h de contato (aproximadamente 105 UFC/mL), mantendo-se constante entre 3 h e 6 h. Para ambas as cepas, o processo de invasão iniciou-se próximo às 3 h de contato com essas células (0,2% do total de bactérias associadas para aEPEC 1711-4 e 0,02% para E. albertii 1551-2). A expressão do gene eae (que codifica intimina) na aEPEC 1711-4 aumentou progressivamente até 6 h de contato, enquanto a expressão dos outros genes representativos de LEE e fliC mantiveram-se constantes. Por sua vez, a E. albertii 1551-2 não apresentou alteração na expressão dos genes estudados em até 6 h de interação. Durante a persistência intracelular, a expressão dos genes estudados manteve-se constante na aEPEC 1711-4, enquanto para a E. albertii, observou-se aumento de pelo menos 8 vezes da expressão desses genes. A análise de genoma da cepa 1551-2 identificou a presença de 31 efetores dependentes do SST3, dentre eles uma variante de TccP2/EspFu2. Conclusão: O SST3 está associado a processos de adesão, colonização, invasão e persistência intracelular nas cepas de aEPEC e E. albertii estudadas, sendo a expressão de cada operon distinta entre elas, indicando que outros reguladores transcricionais e/ou pós-transcricionais poderiam contribuir para as diferenças observadas.
Keywords Escherichia Spp
Diarreia
Patógenos
Attaching And Effacing
Sistema De Secreção Tipo 3
Interação Bactéria-Célula
Language Portuguese
Date 2017-05-30
Research area Estudos De Biologia Celular, Sinalização, Mecanismos De Patogenicidade E Fatores De Virulência Em Patógenos Humanos (Vírus, Bactérias, Fungos E Tripanosomatídeos) E No Cancer
Knowledge area Biologia Celular
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 97p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5554474
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50703

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