Caracterização De Vesículas Extracelulares De Fungos Patogênicos Sob Estresse E De Seu Papel Na Comunicação Celular

Caracterização De Vesículas Extracelulares De Fungos Patogênicos Sob Estresse E De Seu Papel Na Comunicação Celular

Author Leitao, Natanael Pinheiro Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Puccia, Rosana Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Microbiologia E Imunologia
Abstract Extracellular vesicles (EVs) are closed structures that carry to the outside environment a wide variety of cytoplasmic components surrounded by a lipid bilayer membrane in all kinds of prokaryotic and eukaryotic organisms. In fungi, they also have to cross the cell wall and, eventually, a capsule. The molecules already characterized in fungal EVs vary from protein, lipid, polysaccharide, melanin, mRNA, and s(small)RNA. Our group has a number of contributions that helped unravel the EV contents in pathogenic fungi, which are involved in host/pathogen interaction, immune modulation, and potentially in fungal-fungal signaling. Presently, we aimed to characterize EVs from pathogenic fungi grown under stress and to evaluate the role of EVs in fungal cell communication. We used oxidative (5 mM H2O2) and nitrosative (0,5 μM NaNO2) stress in the Paracoccidioides brasiliensis model and the quorum sensing mediators farnesol (50 μM), tyrosol (20 μM), besides oxidative stress (25 mM H2O2), in the Candida albicans model. To isolate EVs using differential centrifugation, both fungi were cultivated for one day under shaking at 37oC in Ham’s F12 defined medium (pH 6.3) supplemented with 1,5% glucose. Under these conditions, we obtained P. brasiliensis yeast cultures and C. albicans yeasts mixed with 20 - 30% filaments. Our results showed that the aforementioned stimuli modulated EV production as to the number and size of the particles, as well as to the proteome, which was analyzed quantitatively. We used RNA-seq analysis to evaluate the RNA content of C. albicans EVs and cells. We observed that stress conditions modulated the mRNA sequences and that the EV mRNA content did not reflect the cellular content, therefore it is not random. Differential sRNA analysis is ongoing. EV uptake assays by C. albicans using lipid fluorescently tagged EVs showed surface and intracellular fluorescence, specially close to filament tips. C. albicans EVs coincubated with fungal cells were able to negatively modulated the C. albicans association with macrophages no matter the EV origin, i. e., from stressed or control cells. The results here described are original and contribute with solid data to the understanding of the role of extracellular vesicles in pathogenic fungi.

Vesículas extracelulares (EVs) são estruturas fechadas que transportam para o ambiente extracelular, em todos os organismos procarióticos e eucarióticos, uma grande variedade de componentes citoplasmáticos protegidos por uma membrana lipídica de camada dupla. Em fungos, as EVs precisam atravessar adicionalmente a parede celular e, eventualmente, uma cápsula. Os componentes que já foram caracterizados em fungos variam entre proteínas, lipídeos, polissacarídeos, melanina, mRNA e s(pequenos)RNA. Nosso grupo tem contribuído com trabalhos que revelaram os componentes das EVs de fungos patogênicos, os quais estão envolvidos na interação fungo/hospedeiro, imunomodulação e, potencialmente, na sinalização entre células fúngicas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar EVs de fungos patogênicos produzidas em situação de estresse e avaliar o papel destas vesículas na comunicação intercelular. Foram empregados os estresses oxidativo (5 mM de H2O2) e nitrosativo (0,5 μM NaNO2) no modelo de Paracoccidioides brasiliensis e os mediadores de quorum sense farnesol (50 μM), tirosol (20 μM), além de estresse oxidativo (25 mM de H2O2) em Candida albicans. Para o isolamento de EVs por centrifugação diferencial, ambos os fungos foram cultivados por um dia sob agitação, a 37oC, em meio definido de Ham F12 (pH 6,3) suplementado com 1,5% de glicose. Nessas condições, obtive-se leveduras de P. brasiliensis e culturas de leveduras de C. albicans com 20 - 30% de formas filamentosas. Nossos resultados mostram que a produção de EVs foi modulada pela ação dos agentes estimulantes em relação ao número/tamanho das EVs e quanto ao proteoma, que foi realizado de forma quantitativa. O conteúdo diferencial de RNA foi avaliado por RNA-seq somente para EVs de C. albicans, bem como para as células de origem. Houve modulação das sequências de mRNA de EVs (e de células) de culturas estressadas e a indicação de que a população de mRNA das EVs não refletiu o conteúdo citoplasmático, ou seja, que o contéudo das EVs não é aleatório. A análise diferencial das sequências de sRNA está em andamento. Em experimentos de captação de EVs, impregnadas com marcadores fluorescentes de membrana, houve fluorescência tanto na superfície como no interior das células fúngicas, notadamente próxima às extremidades de filamentos. EVs de C. albicans coincubadas com o fungo foram capazes de alterar negativamente os índices de associação da C. albicans com macrófagos de cultura e essa alteração foi independente da origem das EVs, isto é, se proveniente de culturas de C. albicans estressadas ou não. Os resultados desta tese são originais e contribuem de maneira sólida para o entendimento do papel das vesículas extracelulares em fungos patogênicos.
Keywords Pathogenic Fungi
Extracellular Vesicles
Fungos Patogênicos
Vesículas Extracelulares
Comunicação Celular
Language Portuguese
Date 2017-12-20
Research area Estudos De Biologia Celular, Sinalização, Mecanismos De Patogenicidade E Fatores De Virulência Em Patógenos Humanos (Vírus, Bactérias, Fungos E Tripanosomatídeos) E No Cancer
Knowledge area Biologia Celular
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 191p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5580478
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50670

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