Técnicas De Biologia Molecular Para Ceratites Infecciosas

Técnicas De Biologia Molecular Para Ceratites Infecciosas

Author Nascimento, Heloisa Moraes Do Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Farah, Ana Luisa Hofling De Lima Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Oftalmologia E Ciências Visuais
Abstract Objectives: To study the conjunctival microbiota and etiologic diagnosis in patients with infectious keratitis due to alpha Herpes virus and Mycobacteria with molecular biology techniques. Methods: Conjunctival microbiota analysis was performed in ocular surface samples in eyes previously submitted to Boston Type I keratoprosthesis surgery with PCR assay with amplicon analysis using electrospray ionization mass spectroscopy (PCR/ESI-MS). To study corneal viral infections real-time PCR was used for Herpes Virus Type 1 and 2 (HSV 1 and 2) and Varicella Zoster Virus in corneal scrapings from typical herpes dendritic keratitis and from the corneal stroma of patients with unspecific infectious keratitis. Polymerase chain reaction–restriction enzyme analysis of the hsp65 gene (PRA-hsp65), DNA sequencing and pulsed-field gel electrophoresis were used to identify Mycobacteria strains isolated in corneal samples of a post-refractive surgery infection outbreak. The same methodology was used to study samples of tap and distilled water, water from the reservoir of the distilling equipment, steamer, and autoclave cassette; antiseptic and anesthetic solutions and surgical instruments. Results: The molecular diagnostic approach using serial polymerase chain reaction and mass spectrometry was comparable with standard microbiologic techniques as a surveillance tool in patients previously submitted to Boston type I keratoprosthesis implantation. Of the 25 patients in the dendritic keratitis group, 21 tested positive for HSV-1 by qPCR analysis. From the unspecific keratitis group (65), nine patients had negative smears, cultures, and qPCR findings. Fifty-six patients had positive cultures: 51 for bacteria, 4 for fungi, and 1 for amoebae. From those, qPCR identified 10 patients who were also positive for virus: one for VZV and nine for HSV-1. Polymerase chain reaction–restriction enzyme analysis of the hsp65 gene (PRA-hsp65), DNA sequencing and pulsed-field gel electrophoresis were used to identify Mycobacteria in eyes with clinical signs of infection. The same strain isolated from the patient’s eyes was obtained in tap distilled water samples, which suggests that the contamination source could have been the distilled water used to rinse the instruments. Conclusion: PCR/ESI-MS is comparable to cultures to study conjunctival microbiota and is a possibility of post-operative follow-up. Real-time PCR was able to demonstrate Herpes Virus in typical cases of Herpes keratitis and in unspecific keratitis initially suspicious of bacteria, suggesting mist infection. Polymerase chain reaction–restriction enzyme analysis of the hsp65 gene (PRA-hsp65), DNA sequencing and pulsed-field gel electrophoresis were important to identify Mycobacteria in a post-refractive surgery Mycobacterium chelonae outbreak. Molecular Biology can be used to investigate ocular infections bringing new insights that contribute to comprehension and correlation of infectious processes.

Objetivo: Avaliar a aplicação de técnicas de biologia molecular para estudo da microbiota conjuntival e diagnóstico etiológico em portadores de ceratites infecciosas por alpha Herpes vírus e por Mycobacteria. Métodos: A análise da microbiota conjuntival foi feita pela colheita de amostras da superfície ocular em olhos submetidos previamente a implante de ceratoprótese Boston tipo 1 pela PCR com análise de amplicon acoplada a espectrometria de massas com fonte de ionização electrospray (PCR/ESI-MS). Para estudo de infecção viral da córnea utilizou-se a PCR em tempo real para vírus Herpes Simplex tipo 1 e 2 (HSV 1 e 2) e Vírus Varicella Zoster (VZV) em amostras obtidas de lesões dendríticas típicas de infecção viral e do estroma corneano de pacientes com suspeita diagnóstica de ceratite infecciosa inespecífica. A PCR de restrição enzimática do gene hsp65, o sequenciamento por DNA, genotipagem e eletroforese em gel de campo pulsado foram usados para identificação das cepas que foram isoladas de amostras da córnea em um surto de infecção por Mycobactéria após cirurgia refrativa. A mesma metodologia foi utilizada para estudo das cepas isoladas do ambiente cirúrgico em que ocorreu o surto. Resultados: O diagnóstico molecular pela PCR/ESI-MS foi comparável às técnicas microbiológicas tradicionais para avaliação pós-operatória de vigilância da microbiota ocular em pacientes submetidos previamente a implante de ceratoprótese Boston tipo I. O qPCR foi positivo em 84% dos pacientes com ceratites dendríticas típicas de infecção viral e em dez dos sessenta e cinco pacientes suspeitos de etiologia infecciosa não específica com cultura positiva para bactéria. Nove foram positivos para HSV-1 e um para VZV. Nenhum paciente teve resultado positivo para a pesquisa de HSV-2. A PCR de análise de restrição enzimática do gene hsp65, sequenciamento por DNA e eletroforese em gel de campo pulsado foram aplicadas de forma a complementar os testes de cultivo no diagnóstico de Mycobactéria nos olhos com sinais clínicos de infecção. Foi isolada a mesma cepa de M. chelonae dos olhos dos pacientes nas amostras de água corrente submetidas a processo de destilação, o que sugere que a fonte de contaminação do surto possa ter sido a água destilada usada para lavagem dos instrumentos cirúrgicos. Conclusões: O uso da PCR/ESI-MS foi eficaz para avaliação da microbiota conjuntival e é uma possibilidade de acompanhamento pós-operatório. Com PCR em tempo real foi possível demonstrar a presença de Herpes vírus em casos típicos de ceratites dendríticas herpéticas e infecciosas inicialmente diagnosticadas como de etiologia bacteriana, sugerindo infecção mista. A PCR de análise de restrição enzimática do gene hsp65, o sequenciamento de DNA e a eletroforese em gel de campo pulsado foram importantes na identificação de Mycobacterium chelonae em um surto após cirurgia refrativa. A biologia molecular pode ser aplicada a investigação de situações de infecção do olho trazendo informações que contribuem para a compreensão da origem e correlação dos processos infecciosos.
Keywords Keratitis
Diagnosis
Polymerase Chain Reaction
Infection
Cornea
Ceratite
Diagnóstico
Reação Em Cadeia De Polimerase
Infecção
Córnea
Language Portuguese
Date 2017-12-20
Research area Biologia Molecular Aplicada A Identificação De Microrganismos Patogênicos Do Segmento Anterior Do Olho.
Knowledge area Pesquisa Básica Sobre Fisiopatogenia
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 0p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5279399
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50592

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