Caracterização Imunofenotípica, Do Perfil De Expressão Gênica E Funcional De Células-Tronco Mesenquimais Derivadas De Medula Óssea De Pacientes Com Mieloma Múltiplo

Caracterização Imunofenotípica, Do Perfil De Expressão Gênica E Funcional De Células-Tronco Mesenquimais Derivadas De Medula Óssea De Pacientes Com Mieloma Múltiplo

Author Fernando, Rodrigo Carlini Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Colleoni, Gisele Wally Braga Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Medicina (Hematologia)
Abstract Background: A growing body of evidence suggests a key role for the tumor microenvironment in the maintenance and progression of various cancers, including solid tumors and hematological malignancies. In multiple myeloma (MM), a cancer of plasma cells, the interaction between MM cells and their surrounding bone marrow (BM) milieu, composed by cellular and noncellular elements, promotes survival, growth, and drug resistance for tumor cells. Among cellular elements, BM mesenchymal stem cells (MSC) deserve most attention because of their emblematic role in disease progression. Several studies have shown differences between MSC from MM patients (MM-MSC) and their normal counterparts (normal donors MSC, ND-MSC), ranging from changing in gene and protein expression profiling, to genetic and functional alterations. Objectives: The aims of this study were to characterize the immunophenotypic, gene expression and functional profiling differences between MM-MSC and ND-MSC, in order to add new information to the pathogenesis of the disease, and to identify potential therapeutic targets. Casuistic and Methods: Nineteen new cases of MM, without any prior treatment, and seven healthy BM donors for allogeneic transplant (not matched by age or gender) were enrolled in this study. BM aspirates were collected and processed to isolate MSC, by manual magnetic sorting (CD105+). MSC from both groups were expanded in vitro until reach the required amount of cells for further experiments. MSC were characterized by flow cytometry and osteoblastic differentiation evaluation. Gene expression profiling was performed by microarray using GeneChip Human Exon 1.0 ST Array platform (Affymetrix). After preprocessing raw microarray data and identification of differentially expressed genes (DEG), gene co-expression network and functional enrichment analyses were performed using bioinformatics tools to identify enriched biological functions and pathways. Finally, in order to functionally validate the findings of the DEG bioinformatics analyses, cell cycle evaluation was performed, by flow cytometry, and telomere length quantification of these cells was done by real-time PCR. Results: We did not observe any difference in immunophenotypic or osteoblastic differentiation ability between MM-MSC and ND-MSC. However, gene expression analysis has showed 485 DEG between these cells, being 280 upregulated and 205 downregulated. Bioinformatics analyses revealed that the main enriched biological functions and pathways among downregulated genes were related to cell cycle progression and activation of the immune response. However, no statistically significant differences were observed between the distributions of these cells at the different stages of the cell cycle nor in the telomere length measurements. Conclusion: Our results suggest that MM-MSC have different gene expression profiling when compared to ND-MSC, confirming previous studies. Among the deregulated functions in MM-MSC as a result of the disease, we highlight the alterations found in genes responsible for cell cycle progression and immune system activation, which suggest, respectively, that MM-MSC are permanently dependent of MM cells, and that they collaborate for the immune system evasion by the tumor cells. New approaches targeting the last aspect could be of interest in MM treatment.

Introdução: Evidências crescentes sugerem que o microambiente tumoral possui papel chave na manutenção e progressão de vários tipos de câncer, incluindo tumores sólidos e neoplasias malignas hematológicas. No mieloma múltiplo (MM), um câncer de células plasmáticas, a interação entre as células de MM e o ambiente circundante da medula óssea (MO), composto por elementos celulares e não celulares, promove a sobrevivência, o crescimento e a resistência a drogas das células tumorais. Entre os elementos celulares, as células-tronco mesenquimais da MO (do inglês, mesenchymal stem cells, MSC) merecem maior atenção devido ao seu papel emblemático na progressão da doença. Vários estudos tem mostrado diferenças entre as MSC de pacientes com MM (MM-MSC) e suas correspondentes normais (do inglês, normal donors MSC, ND-MSC), compreendendo desde alterações no perfil de expressão gênica e proteica, até alterações genéticas e funcionais. Objetivos: Os objetivos desse estudo foram caracterizar as diferenças nos perfis imunofenotípico, de expressão gênica e funcional entre as MM-MSC e as ND-MSC, com intuito de agregar novas informações à patogênese da doença e identificar potenciais alvos terapêuticos. Casuística e Métodos: Foram incluídos no estudo 19 casos de MM recém-diagnosticados, sem tratamento prévio, e sete doadores saudáveis de MO para transplante alogênico (não pareados por idade ou gênero). Os aspirados de MO foram coletados e processados para isolar as MSC, por separação magnética manual (CD105+). As MSC de ambos os grupos foram expandidas in vitro até atingir a quantidade de células necessária para os demais experimentos. As MSC foram caracterizadas por citometria de fluxo e por avaliação do potencial de diferenciação em osteoblastos. A análise do perfil de expressão gênica foi realizada por microarray, utilizando a plataforma GeneChip Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix). Após o pré-processamento dos dados brutos de microarray e identificação de genes diferencialmente expressos (GDE), foram realizadas análises de rede de co-expressão gênica e de enriquecimento funcional, utilizando ferramentas de bioinformática, a fim de identificar funções e vias biológicas enriquecidas. Por fim, com intuito de validar funcionalmente os achados das análises de bioinformática dos GDE, foi realizada a avaliação do ciclo celular, por citometria de fluxo, e a quantificação do comprimento telomérico dessas células por PCR em tempo real. Resultados: Não foram observadas diferenças imunofenotípicas, nem na capacidade de diferenciação em osteoblastos entre as células tumorais e normais. A análise de expressão gênica, por sua vez, mostrou 485 GDE nas MM-MSC, sendo 280 com expressão aumentada e 205 com expressão diminuída. As análises de bioinformática revelaram que as principais funções e vias biológicas enriquecidas, entre os genes com expressão diminuída, estavam relacionadas à progressão do ciclo celular e à ativação da resposta imune. Entretanto, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre as distribuições dessas células nas diferentes fases do ciclo celular, nem no tamanho do comprimento telomérico das mesmas. Conclusão: Nossos resultados sugerem que as MM-MSC possuem perfil de expressão gênica distinto das ND-MSC, confirmando estudos anteriores. Dentre as funções desreguladas nas MM-MSC em decorrência da doença, destacam-se as alterações encontradas em genes responsáveis pela progressão do ciclo celular e pela ativação do sistema imune, os quais sugerem, respectivamente, que as MM-MSC são permanentemente dependentes das células de MM e que elas colaboram para a evasão do sistema imune por parte das células tumorais. Novas abordagens visando o último aspecto podem ser interessantes no tratamento do MM.
Keywords Multiple Myeloma
Mesenchymal Stem Cells
Transcriptome
Mieloma Múltiplo
Células-Tronco Mesenquimais
Transcriptoma
Language Portuguese
Date 2017-11-21
Research area Doenças Linfoproliferativas Crônicas
Knowledge area Onco Hematologia
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 103p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5730463
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50385

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