Receptores peptídicos at1, b1 e b2: modelos de estudos sintéticos e conformacionais dos seus fragmentose da pesquisa de sítios de interação com os respectivos agonistas

Receptores peptídicos at1, b1 e b2: modelos de estudos sintéticos e conformacionais dos seus fragmentose da pesquisa de sítios de interação com os respectivos agonistas

Autor Lopes, Douglas Duarte Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Nakaie, Clovis Ryuichi Nakaie Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Resumo O objetivo principal desta tese se insere no campo dos projetos que procuram pesquisar e avaliar possíveis regiões de ligação de peptídeos de relevância fisiológica como os vasoativos angiotensina II (AngII), bradicinina (BK) e desArg9-BK (DBK) nos seus respectivos receptores, AT1, B2 e B1. Estes receptores pertencem à família A dos GPCRs (G-protein coupled receptors), sendo a rodopsina, representante dos mesmos. Estas macromoléculas são compostos por sete segmentos transmembranares (TM), um amino e outro carboxi-terminal, apresentando portanto três alças externas (EC) e três internas (EI) em sua estruturação na membrana plasmática. São todos pertencentes à mesma classe da ?-quimiocina, cujo receptor CXCR4 foi recentemente detalhado em termos estruturais, englobando inclusive a parte do hipotético sítio de ligação do agonista. Neste aspecto, tem-se proposto que esta classe de macromoléculas possui sítios de ligações dos agonistas compostos por um fragmento da terceira alça externa (P13) ligado diretamente a uma da porção amínica (P15) mas tendo também uma ponte S-S entre estes dois segmentos, formando uma estrutura cíclica nestes compostos. Com base nestas considerações, decidimos investigar a validade desta hipótese, iniciando com a síntese destes fragmentos peptídicos cíclicos do tipo (P15-P13), de conformidade com as sequências peptídicas já conhecidas na literatura destes receptores. A escolha das sequências P15 e P13 dos receptores foi baseada nas posições conservadas ocupadas pelos resíduos de Cys em ambos os segmentos e válidos para os três receptores. Deste modo, o alinhamento feito para a seleção destas sequências consideraram as posições conservadas 18 e 274, 25 e 294 e finalmente 52 e 309, para os resíduos de Cys nos receptores AT1, B1 e B2, respectivamente. O passo seguinte envolveu portanto a síntese de agonistas ou análogos que pudessem ser utilizados para os testes de interação com estes fragmentos cíclicos dos receptores acima mencionados. Deste modo, além da AngII, BK e da DBK, análogos dos mesmos contendo o derivado de aminoácido e marcador paramagnético Toac (ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil-4-amino-4-carboxílico) foram obtidos. A ligação deste marcador foi efetuada nas extremidades amínicas destes peptídeos vasoativos e também internamente (posição 3). Além disto, por ser um radical livre mas estável e reconhecidamente supressora de fluorescência devido ao caráter paramagnético do seu grupamento nitróxido, esta molécula-repórter poderia fornecer dados de possíveis interações intermoleculares dos Toac-peptideos com alguns do fragmentos dos receptores acima mencionados, revelando portanto dados estruturais de grande importância da ligação destes agonistas, tanto se aplicando a espectroscopia da RPE quanto a da fluorescência. Deste modo, no caso da ocorrência de uma interação por afinidade entre Toac-agonista e um dos fragmentos do receptor, este complexo formado pode induzir um aumento da imobilização do agonista contendo o grupo Toac, detectável via RPE ou supressão da fluorescência em função de uma possível interação deste marcador com grupos fluoróforos dos fragmentos do receptor. Baseado nestas possibilidades, os derivados biologicamente ativos Toac1-AngII, Toac0-BK e Toac0-DBK foram obtidos juntamente com os correspondentes inativos (Toac3-AngII; Toac3- BK e Toac3-DBK), estes últimos sendo utilizados como controles negativos destes experimentos. Diferentemente dos Toac- derivados da AngII e BK que já haviam sido anteriormente sintetizados e avaliados em termos de atividade biológica, a DBK e seus dois análogos com Toac (posições 0 e 3) foram obtidos nesta tese, sendo também avaliados em termos de potência biológica, via experimentos de contração muscular em tecidos de fundus de estômago de camundongos. Testou-se primeiramente a ocorrência ou não de interação entre estes Toac-peptídeos com os fragmentos do AT1, B1 e B2, por RPE, obtendo-se resultados que parecem comprovar a hipótese já discutida de que os sítios de interação destes receptores são compostos por fragmentos do tipo (P15-P13) mas ciclizados por pontes dissulfeto. Apenas os agonistas (nativos ou ativos com Toac) apresentaram interações intermoleculares com estes tipos de segmentos dos receptores, não se observando evidências de afinidade com os demais derivados inativos da AngII, BK e DBK, todos contendo Toac na posição 3. Além disto, para uma melhor confirmação destes resultados, fragmentos-controle dos receptores como o P15 e P13 isoladamente ou mesmo o composto contendo estes dois segmentos mas ligados apenas por uma ponte S-S [(não cíclico, aberto ? (P15-P13)a] se mostraram incapazes de interagir com os análogos ativos (Toac1-AngII, Toac0-BK e Toac0-DBK). De grande relevância, os peptídeos ativos Toac0-BK e Toac0-DBK apresentaram afinidades pelos segmentos cíclicos, tanto de B1 quanto de B2. No entanto, interações ligeiramente maiores foram observadas entre o derivado de BK e o fragmento cíclico do B2 e do DBK com o do B1, indicando portanto, especificidade de interações entre estas moléculas com os seus respectivos receptores. Por outro lado, não se observaram afinidades cruzadas envolvendo o outro tipo de receptor (AT1), isto é, o fragmento cíclico do AT1 interagiu apenas com Toac1-AngII e não com Toac0 BK e Toac0-DBK e os fragmentos cíclicos de B1 e B2 interagiram exclusivamente com os derivados ativos da DBK e BK, respectivamente e não com o Toac1-AngII. Por fim, destaque-se que todas estas especificidades de interações observadas entre agonistas, não agonistas e os diferentes fragmentos dos receptores estudados, foram também evidenciada pelos dados advindos de experimentos feitos por fluorescência, principalmente via mensuração do grau de supressão medida neste processo de interação intermolecular. Neste caso, diferentemente do aumento da imobilização molecular detectada por RPE, a ocorrência de interações intermoleculares se refletiu na diminuição significativa da intensidade de fluorescência. Estes resultados sugerem portanto a existência de um modelo de sítio de interação nestes receptores para a ligação dos agonistas, formados por um fragmento da região N-terminal ligado a um outro da terceira alça externa e ciclizado, via ponte S-S. Estes achados são concordantes com estrutura proposta recentemente por estudos de modelagem e difração de raio X de alta resolução do receptor CXCR4 da família da quimiocina. Apesar do tema central desta tese ter envolvido portanto o monitoramento de possíveis sítios de interações da AngII, BK e DBK, via RPE e fluorescência com os seus respectivos receptores, também resolvemos continuar com o nosso contínuo esforço de aprimoramento da metodologia da síntese peptídica efetuada em suportes poliméricos. Como modelo de sequencia peptídica a ser estudada, escolhemos um fragmento transmembranar (TM) de 32 aminoácidos (66-97) do receptor codificado pelo oncogene MAS, também do tipo GPCR. Em termos sintéticos, notou-se um progressivo aumento de dificuldade das reações de acoplamento de aminoácidos, principalmente a partir da região dos resíduos 9-10 e sistemas de solventes com forte tendência nucleofílica (ex. DMSO) passaram a ser melhor solvatantes do que os clássicos DCM e DMF, rotineiramente utilizados nesta metodologia de síntese. Os estudos de solvatação destas peptidil-resinas foram efetuados, via medição por microscopia direta do tamanho dos grãos em diferentes solventes (inchamento) ou por RPE, via marcação das peptidil-resinas com o Toac que fornece dados de grau de mobilidade e dinâmica das cadeias peptídicas ligadas à matriz polimérica no estado solvatado. Fragmentos do peptídeo TM-32 foram também clivados da resina de oito em oito posições e os seus graus de pureza determinados. Observou-se uma queda de rendimento de síntese bastante acentuada, concomitante ao alongamento da sequência, atingindo-se ao final, valor ao redor de apenas 20% (TM-32). Estes dados são portanto indicativos de que na metodologia da síntese peptídica em fase sólida, mesmo após cerca de cinco décadas de contínuo aprimoramento, ainda persistem sérios problemas de síntese a serem transpostos.
Assunto receptores
fragmentos
Idioma Português
Data 2014-10-29
Publicado em LOPES, Douglas Duarte. Receptores peptídicos at1, b1 e b2: modelos de estudos sintéticos e conformacionais dos seus fragmentose da pesquisa de sítios de interação com os respectivos agonistas. 2014. 101 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.
Linha de pesquisa Bioquímica
Área de concentração Ciências biológicas
Editor Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 101 p.
Fonte https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=1545015
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48870

Mostrar registro completo




Arquivos deste item

Arquivos Tamanho Formato Visualização

Não existem arquivos associados a este item.

Este item aparece na(s) seguinte(s) coleção(s)