Envolvimento de proteoglicanos na regulação da atividade da óxido nítrico síntase em células cho

Envolvimento de proteoglicanos na regulação da atividade da óxido nítrico síntase em células cho

Autor Lucena, Sheyla Varela Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Tersariol, Ivarne Luis dos Santos Tersariol Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Resumo The interactions between adjacent cells and with their extracellular matrix (ECM) are essential to cell functions. Cell inputs are mediated by specific receptors that transduce signals from ECM and cell surface components, such as integrins, proteoglycans (PGs), among others. Proteoglycans are able to interact with many ECM proteins through their glycosaminoglycans chains (GAGs), among them there are the integrins, which can also interact with other ECM molecules. These interactions (GAGs/integrins) shape the ECM ternary complex integrin/GAGs/proteins regulating the biological role of integrins. ECM-derived mechanical stimuli can be transmitted to the intracellular environment through association between integrins and proteoglycans in lipid rafts or focal adhesion complex, regulating NO intracellular production.[OBJECTIVE] Taking into account the tight regulation among proteoglycans, integrins and NO production, our aim was to investigate GAGs role in NO production in CHO wild-type cells and a mutant lacking Xylosiltransferase, a key enzyme in GAGs biosynthesis, CHO-745. [METHODS] The REOOX status in these cells were assessed through GSH/GSSG, NAOPH/NAOP ratios, thiol groups, GPx, Trx, catalase gene expression analysis by qPCR. CHO cell viability was evaluated after an over load of pro oxidants. Reactive oxygen species, superoxide and nitric oxide, were measured in both cell lines through fluorescent probes in TIRF and confocal microscopes. NAOPH oxidase as well as nitric oxide synthases gene expression was also quantified by western blot and flow cytometry.Cell localization of eNOS was determined by confocal microscopy. The signaling pathway elicited to regulate eNOS activity in CHO was also determined by,western blotting, TIRF and confocal microscopy.[RESUL TS]Our results show that CHO-745 cells are more susceptible to cell death induced by pro-oxidant agent in comparison to wild-type CHO-K1 cells. Our data suggests that the CHO-745 cells spontaneously produce around 12-fold more ROS than CHO-K1. The main source of ROS produced by CHO-745 cells is associated with its high NO production, which is also approximately 12-fold in CHO-745 compared to CHO-K1. Our results show that eNOS isoform is the major responsible for NO production in CHO cells. They also show the presence of GAGs found in CHOK1 inhibit the signaling pathway Integrin / FAK / PI3K / Akt, which leads to activation of eNOS by phosphorylation in its Ser1177 residue. In addition, CHOK1 show higher constitutive activation of PKC enzyme, about 2-fold more than CHO-745. This activation results in a further phosphorylation of an inhibitory residue of eNOS (Thr495) by PKCa. The higher NO production in CHO-745 also promotes a high rate of S-nitrosylation in cysteine residues, as well as higher rates of nitration in phenolic groups of tyrosine residues. It was observed that CHO-745 have a lower basal levels of superoxide compared to CHO-K1. Our results showed that the CHO-745 have higher gene expression of GPx, Trx-1 and catalase in response to their increased production of ROS. [CONCLUSION] These results show that eNOS is more active in mutant CHO- 745cells lacking Xylosiltransferase due to their greater phosphorylation in its excitatory residue Ser1177 and lower phosphorylation levels in its inhibitory residue Thr495, the phosphorylation of these both residues is modulated by GAGs / PG in the cell surface. Collectively, these results show that GAGs are involved in the control of the cellular oxidative / nitrosative balance.

Introdução. A interação das células com a matriz extracelular (MEC) e com as células vizinhas são essenciais para o desempenho das funções celulares. A maneira pela qual as células adquirem informações sobre o meio extracelular se dá por meio de interações mediadas por receptores específicos entre a MEC e os constituintes de superfície celular, tais como, integrinas, proteoglicanos entre outros. Dados da literatura mostram que os proteoglicanos, via suas cadeias de glicosaminoglicanos (GAGs), são capazes de interagir com várias proteínas da MEC e com integrinas da superfície celular que por sua vez, interagem com moléculas da MEC. Essas interações GAGs/integrina modulam a formação do complexo ternário integrina/GAGs/proteínas da MEC controlando dessa forma o papel biológico das integrinas. Estímulos mecânicos derivados da MEC podem ser transmitidos para o meio intracelular pela interação direta ou indireta das integrinas que se associam com proteoglicanos em regiões de "lipíd rafts" e no complexo focal de adesão controlando a produção intracelular de NO. [Objetivos] Considerando que os proteoglicanos controlam a atividade de integrinas na superfície celular, decidimos investigar a influência dos GAGs nos mecanismos responsáveis pela produção de óxido nítrico em células selvagem CHO-K1, bem como, em células mutante CHO-745, defectiva da enzima xilosiltransferase, enzima fundamental para a biossíntese de GAGs. [Métodos] Analisamos o balanço redox nas células CHO-K1 e CHO-745 pela quantificação de GSH/GSSG, de grupos tióis, da razão NADP/NADPH, bem como, pela análise da expressão gênica das enzimas GPx, TRX e catalasepor RTPCR. Analisamos a susceptibilidade das células CHO para a morte celular frente a sobrecarga do agente pró-oxidante. Os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROS), de superóxido e de óxido nítrico foram analisados em ambas as linhagens celulares CHO por sondas fluorescentes em microscopia TIRF e confocal. Também foi analisada a expressão gênica das isoformas de NADPH oxidase e NO sintase envolvidas na produção de superóxido e NO nas células CHO por westem blottíng e citometria de fluxo. A localização celular da enzima eNOS nas células CHO foi analisada por microscopia confocal. Verificamos a via de sinalização celular envolvida no controle da atividade da enzima eNOS nas células CHO por western blotting, microscopia TIRF e confocal. [Resultados]. Nossos resultados mostram que as células mutantes CHO-745 são mais susceptíveis a morte celular induzida por agente pró-oxidante que as células selvagem CHO-K1. Verificamos que as células mutantes CHO-745 produzem espontaneamente cerca de 12 vezes mais EROS do que as células selvagens CHO-K1. A principal fonte de EROS produzidos espontaneamente pelas células CHO-745 está associada a sua elevada produção de NO, o qual também cerca de 12 vezes maior nas células mutantes CHO-745 em relação às células selvagem CHO-K1. Os resultados mostram que a isoforma eNOS é a principal responsável pela produção de NO nas células CHO. Os resultados mostram que a presença de GAGs, verificada nas células CHO-K1 inibe a via de sinalização Integrina/FAKlPI3K/Akt,. a qual leva a ativação da eNOS por fosforilação de Ser1177. Além disso, as células CHO-K1 apresentam maior ativação constitutiva da enzima PKC, cerca de duas vezes mais, do que as células CHO-745. Essa ativação da PKCa resulta na fosforilação no resíduo inibitório Thr495 da eNOS. A elevada produção de NO nas células CHO-745 promoveu também uma elevada taxa de S-nitrosilação de resíduos de cisteína em suas proteínas, bem como, elevada taxa de nitração de grupos fenólicos de tirosina. Ainda foi observado que as células CHO-745 possuem uma concentração basal de superóxido menor em comparação com as células CHO-K1. Nossos resultados mostram que as células CHO-745 apresentam níveis elevados de expressão gênica das enzimas GPx, TRX e catalase em resposta a sua maior produção de EROs. [Conclusão] Esses resultados mostram que a enzima eNOS está muito mais ativada nas células mutante CHO-745 do que as células CHO-K1 devido a sua maior fosforilação do resíduo excitatório Ser1177 e menor fosforilação em seu resíduo inibitório Thr495, a fosforilização desses resíduos é modulada por GAGs/PG da superfície celular. Esses resultados mostram que os GAGs estão envolvidos no controle do balanço oxidativo/nitrosativo celular.
Assunto oxido nítrico
enos
glicosaminoglicanos
proteoglicanos
sinalização celular
células cho
Idioma Português
Data 2015-04-29
Publicado em LUCENA, Sheyla Varela. Envolvimento de proteoglicanos na regulação da atividade da óxido nítrico síntase em células cho. 2015. 154 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.
Linha de pesquisa Bioquímica
Área de concentração Ciências biológicas
Editor Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 154 p.
Fonte https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=2359173
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48777

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