Proteínas ligantes de yih1/impact: relevância biológica dessas interações

Proteínas ligantes de yih1/impact: relevância biológica dessas interações

Autor Silva, Richard Cardoso da Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Castilho, Beatriz Amaral de Castilho Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Microbiologia e Imunologia
Resumo The mammalian protein IMPACT, preferentially expressed in neurons, and its Saccharomyces cerevisiae orthologue Yih1, compete with GCN2 for the same binding site on GCN1, thus, acting as a GCN2 down-regulator. We have previously shown that the knockdown of endogenous IMPACT in neurons and the overexpression of Yih1/IMPACT in yeast and fibroblasts inhibit the activation of GCN2. However, deletion of YIH1 does not lead to a detectable increase in basal and/or induced eIF2? phosphorylation, suggesting that Yih1 is not a general inhibitor of GCN2 in yeast. Despite intensive efforts to uncover a phenotypic defect of the lack of Yih1 in otherwise wild-type cells, none has been identified so far. Thus, the physiological role of endogenous Yih1 remains largely unknown. Here, we show that yeast cells lacking Yih1 accumulate during the G2/M phases of the cell cycle, and this phenotype does not depend on GCN1 and GCN2. We present several lines of evidences indicating that Yih1 forms a complex with the cell division cycle protein kinase Cdc28. This interaction is enhanced when Cdc28 is actively engaged in the cell cycle, associated with its regulatory subunits, suggesting that Yih1 could be modulating the activity of Cdc28 in specific stages of the cell cycle. We also demonstrate, by in vivo bimolecular fluorescence complementation, that Yih1 and Cdc28 interact with each other, confirming Yih1 as a bona fide Cdc28 binding partner. We further show that IMPACT binds to Cdk1, the Cdc28 homologue in mammals. Aminoacid substitutions within the helix H2 of the RWD domain of Yih1 enhance Yih1-Cdc28 association. Interestingly, the overexpression of this Yih1 mutant, but not of the wild type Yih1, leads to the same phenotype observed in the YIH1 deleted mutant, supporting the notion that Yih1 affects the cell cycle through Cdc28. It was previously described that Yih1 forms a hetero-dimeric complex with G-actin. Haplo-insufficiency of actin hinders GCN2 activation, a phenotype that is partially dependent on Yih1. However; it is unknown whether this interaction is conserved in mammalian cells. Here we show that actin unambiguously co-purifies with IMPACT in neuronal-like N2a cells. Pharmacological depolymerization of F-actin with the consecutive accumulation of G-actin, leads to a significant increase in IMPACT-actin interaction, suggesting that IMPACT binds monomeric actin, in agreement with data previously obtained in yeast. Importantly, we have found that the disruption of F-actin in fibroblasts, which express little IMPACT, promptly induces the activation of GCN2 and the subsequent phosphorylation of its substrate eIF2?. In addition, we also describe other interactors of IMPACT in N2a cells. The results shown in this work provide relevant informations regarding the role of Yih1/IMPACT for cell biology.

A proteína IMPACT de mamíferos, preferencialmente expressa em neurônios, e sua ortóloga em Saccharomyces cerevisiae, competem com GCN2 pelo mesmo sítio de ligação em GCN1, funcionando assim como reguladores negativos da atividade de GCN2. Foi previamente demonstrado que tanto a depleção de IMPACT endógena em neurônios como a super expressão de Yih1/IMPACT em levedura e fibroblastos inibem a atividade de GCN2. Contudo, a deleção de YIH1 não leva a um aumento detectável da fosforilação basal ou induzida de eIF2?, sugerindo que Yih1 não seja um inibidor global de GCN2 em S. cerevisiae. Apesar de intensos esforços, nenhum fenótipo associado a falta de Yih1 em células selvagens foi identificado. Assim, o papel fisiológico desempenhado por Yih1 ainda é pouco conhecido. Neste trabalho, mostramos que leveduras desprovidas de Yih1 acumulam durante a fase G2/M do ciclo celular, sendo este fenótipo independente de GCN1 e GCN2. Apresentamos algumas evidências que indicam que Yih1 forma um complexo com a quinase dependente de ciclina Cdc28. Esta interação é mais intensa quando Cdc28 encontra-se ativa, engajada no ciclo celular, associada a suas subunidades de regulação, sugerindo que Yih1 possa modular a atividade de Cdc28 em estágios específicos do ciclo celular. Demonstramos por meio de Complementação de Fluorescência Bimolecular que a proteína Yih1, expressa a partir de seu locus cromossomal, também forma um complexo com Cdc28 in vivo, indicando assim que essa associação também ocorre sob condições e concentrações fisiológicas. Nós mostramos ainda que IMPACT forma um complexo com Cdk1, a ortóloga de Cdc28 em mamíferos. Substituições de aminoacidos na hélice H2 do domínio RWD de Yih1 aumenta a associação entre Yih1 e Cdc28. Interessantemente, a superexpressão desse mutante de Yih1, mas não de Yih1 selvagem, leva a um fenótipo similar ao observado em células deletadas para YIH1, dando suporte a ideia de que Yih1 afeta o cilo celular via Cdc28. Foi previamente demonstrado que Yih1 forma um complexo hetero-dimérico com a actina-G. Em leveduras haploinsuficientes para actina há diminuição da resposta mediada por GCN2 e esse fenótipo é parcialmente dependente de Yih1. Entretanto, ainda não se sabia se essa interação é conservada em células de mamíferos. Demonstramos aqui que a actina inequivocamente co-purifica com IMPACT em células N2a. A depolimerização farmacológica da actina-F com o consequente acúmulo de actina-G promove um aumento significativo da interação entre IMPACT e actina, sugerindo que IMPACT interage com a actina-G, em conformidade com dados previamente obtidos em levedura. Importantemente, nós descobrimos que disturbios da actina-F em fibroblastos, que expressa quantidades menores de IMPACT, prontamente induz a ativação de GCN2 e a subsequente fosforilação de seu substrato eIF2?. Além do mais, nós descrevemos outros interatores de IMPACT em células N2a. Os resultados mostrados neste trabalho fornecem informações relevantes em relação ao papel de Yih1/IMPACT para a biologia celular.
Assunto imprinted and ancient
yeast impact homologue
gcn2
eif2
cdc28
ciclo celular
Idioma Português
Data 2014-11-30
Publicado em SILVA, Richard Cardoso da. Proteínas ligantes de yih1/impact: relevância biológica dessas interações. 2014. 134 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.
Linha de pesquisa Microbiologia
Área de concentração Ciências biológicas
Editor Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 134 p.
Fonte https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=1947219
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48605

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