Análise da composição lipídica de corpos lipídicos isolados de fungos patogênicos e avaliação de seu papel biológico na resistência a antifúngicos azólicos

Análise da composição lipídica de corpos lipídicos isolados de fungos patogênicos e avaliação de seu papel biológico na resistência a antifúngicos azólicos

Autor Paula, Daisy Maria Bentes de Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Toledo, Marcos Sergio de Toledo Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Resumo Lipids are critical molecules for proper cell function. Given its importance, specific lipid species are stored in organelles known as lipid droplets (LDs), which are intimately involved in lipid homeostasis. Recent studies have shown that lipid bodies present other important functions besides lipid reservoir and membranes biogenesis. These cell structures might also be involved in cell signaling, yrotection against lipotoxicity, inflammation, cancer, and pathogen-host interactions. Although there are several studies on mammalian cell LDs, the role of LDs in pathogenic fungi is not fully understood. In this study, we aim to characterize the lipid content of this organelle in pathogenic fungi and investigate the possible role of LDs in fungal resistance to azolic antifungal drugs. LDs were extracted from five different fungal species without using enzyme-disruption of the cell wall. The charaderization of lipid species was verified by column chromatography, HPTLC, and by electrospray mass spectrometry (ESI-MS and APCI-MS). Mass spectrometry of the chloroform fractions obtained by column chromatography revealed that the major lipids extracted from LDs isolated from Candida albicans, C. albicans 23R (resistant strain), C. dubliniensis, Aspergillus fumigatus and Para coccidioides bresitiensis were triacylglycerols (TAGs) and sterol-esters (SEs). In general by characterization of TAG, we were able to identify a total of 41 species of TAGs. TAG molecules that were more abundant in ali five species were 50:1, 50:2, 50:3, 52:1, 52:2, 52:3, 52:4, 54:1, 54:2, 54:3, 54:4, 54:5 and 54:6. DAG species were found in minor amounts, and the main compositions found were: 34:0, 34:1, 34:2, 36:0, 36:1, 36:2, 36:3, 36:4, 38:2,40:0, and compositions 34:1, 34:2, 36:2, 36:4 and 38:2 were the major species. Phospholipids (PLs) were also observed, probably from the LD monolayer. Corroborating the literature, the five fungal species exhibited a phospholipid profile that contained mostly phosphatidilcholines, followed by phosphatidilethanolamine and phosphatidilinositol. Sterol analysis revealed the ergosterol as the main sterol, excepted for C. albicans 23R and P. brasiliensis that presented mostly brassicasterol. SEs analysis revealed a wide range of possible combinations between sterols species and fatty acids, varying according to the fungal specie evaluated. For evaluation of biological role of LDs in azoles resistance, experiments cells treated with fluconazol showed the presence of oxide squalene in LD ~ctions in high levels when compared to the control group, especially in the resistant strain. These findings indicate that excess of specific lipid species triggered azolic antifungal drug treatment are sequestered and stored in lipid droplets. This also suggests that the non-resistant strain is less effective in the accumulation of ese lipotoxic compounds. We hypothesize that the resistant strain might have an over expression of genes related to LD biogenesis that increases the cell capacity of s orage of lipotoxic molecules in the LDs. This event might work as a resistance mechanism to azolic antifungal drugs, adding an important new biological role for LDs.

Os lipídeos são moléculas imprescindíveis para o equilíbrio funcional celular, atuando, por exemplo, na produção de hormônios e na composição estrutural das membranas biológicas. Dada sua importância, as células possuem organelas especializadas em sua estocagem. Estes reservatórios são conhecidos como corpos lipídicos (CLs) e estão intimamente envolvidos na homeostase. lipídica. Estudos recentes têm mostrado que os CLs têm funções que vão além do reservatório de lipídeos e biogênese de membranas. Eles também podem estar envolvidos, como por exemplo, na sinalização celular, proteção contra lipotoxicidade, inflamação e câncer, e, interação patógeno-hospedeiro. Embora haja vários estudos sobre CLs de células de mamíferos, o papel destas organelas em fungos patogênicos não é totalmente compreendido. Neste estudo, propusemos caracterizar o conteúdo lipídico dos CLs de fungos patogênicos e investigar o possível papel destas organelas na resistência a antifúngicos azólicos. CLs de cinco espécies de fungos diferentes foram extraídos por um protocolo adaptado, sem alise enzimática da parede celular, e a caracterização das espécies de lipídeos foi realizada por diferentes métodos de purificação, tais como cromatografia, e através da técnica de espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS e APCI-MS). As análises de espectrometria de massas das frações clorofórmicas obtidas por cromatografia em coluna revelaram que as principais espécies lipídicas presentes nos CLs isolados de Candida albicans, C. albicans 23R (linhagem resistente), C. dubliniensis, Aspergillus fumigatus e Paracoccidioides brasiliensis foram TAGs e esterol-ésteres. Na caracterização geral da TAG, foram identificados um total de 41 espécies de TAGs. As moléculas de TAG mais abundantes nas cinco espécies analisadas foram: 50:1, 50:2,50:3, 52:1, 52:2, 52:3, 52:4, 54:1, 54:2, 54:3, 54:4, 54:5 e 54:6. Já as espécies DAG foram encontradas em menores quantidades. As principais composições identificadas foram: 34:0, 34: 1, 34:2, 36:0, 36: 1, 36:2, 36:3, 36:4, 38:2, 40:0, sendo as composições 34:1, 34:2, 36:2, 36:4 e 38:2 as espécies majoritárias. Espécies de fosfolipídios (FLs) também foram observadas, provenientes provavelmente da membrana dos CLs. As cinco espécies de fungos avaliadas exibem um padrão no perfil de FLs, onde as fosfatidilcolinas são predominantes, xv seguidas pelas fosfatidiletanolaminas e fosfatidilinositol, corroborando com dados disponíveis na literatura. A análise dos esteróis revelou o ergosterol como principal representante da classe, com exceção para C. albicans 23R e P. brasiliensis, onde o brassicasterol se mostrou predominante. A análise das espécies de esterol-ésteres (EEs) revelou uma grande variedade de combinações possíveis entre espécies de esteróis e ácidos graxos, variando de acordo com a espécie do fungo avaliado. Para a avaliação de um possível envolvimento dos CLs na resistência a drogas azólicas, experimentos realizados com células tratadas com Fluconazol mostraram a presença de óxido de esqualeno em frações de CLs em níveis elevados, quando comparados com o grupo de controle, especialmente na linhagem resistente. Estes achados indicam aparentemente que o excesso de espécies lipídicas específicas desencadeadas pelo tratamento com antifúngico azólico são armazenados nos CLs. Também sugerem que a linhagem não resistente é menos eficaz no acúmulo destes compostos lipotóxicos. Nossa hipótese é a de que possa haver uma superexpressão de genes relacionados com a biogênese de CLs na linhagem resistente e que aumenta a capacidade da célula de armazenamento de moléculas lipotóxicas nos CLs. Este evento poderia funcionar como um mecanismo de re.sistência aos antifúngicos azólicos, acrescentando um novo e importante papel biológico aos CLs. xvi
Assunto fungos
composição lipídica
corpos lipídicos
espectrometria de massas
papel biológico
Idioma Português
Data 2016-11-30
Publicado em PAULA, Daisy Maria Bentes de. Análise da composição lipídica de corpos lipídicos isolados de fungos patogênicos e avaliação de seu papel biológico na resistência a antifúngicos azólicos. 2016. 145 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
Linha de pesquisa Bioquímica
Área de concentração Ciências biológicas
Editor Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 145 p.
Fonte https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3882900
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48523

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