Estudo da 3-metilglutaconil coa hidratase da via de degradação de leucina de trypanosoma brucei

Estudo da 3-metilglutaconil coa hidratase da via de degradação de leucina de trypanosoma brucei

Author Lima, Mariana Leao de Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Schenkman, Sergio Schenkman Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Microbiologia e Imunologia
Abstract The parasite Trypanosoma brucei is the causative agent of African Trypanosomiasis. It is a flagellated protozoan parasite that develops into tsetse flies and blood and lymphatic systems of various mammals causing sleeping sickness in humans and Nagana in animals. The parasite acquires nutrients such as sugars, lipids and amino acids from their hosts. Amino acids are used to generate energy and also for protein and lipid synthesis. However, it is still unknown how T. brucei catabolize most of the amino acids, among them, the branched chain amino acids as leucine, isoleucine and valine. This thesis focused in understanding the role of the leucine degradation pathway in the T. brucei, as leucine is one of the precursors for the production of mevalonato and then to the synthesis of ergosterol, an essential steroid for the parasite. Therefore, we characterized the enzyme named 3-methylglutaconil-Coenzyme A hydratase (3-MGCoA-H), which transform 3-H-MGCoA into 3-hydroxymethylglutaryl coenzyme A (3-HMG), a substrate for the synthesis of mevalonate after the action of 3-hidroximetilglutaril CoA reductase (HMGR). Initially, we detected the gene and enzymatic activity of 3 H-MGCoA in the T. brucei. We found that it is a dimer, which localizes in the mitochondrial matrix and is expressed in both procyclic and bloodstream forms. The depletion of 3-MGCoA-H by RNA interference (RNAi) affected minimally the proliferation of parasite procyclic forms and has no effect on bloodstream forms. However, the addition of excess of leucine in the medium caused growth defects after RNAi induction in both parasite forms forms. This growth inhibition was reverted by addition of fetal bovine serum, but not by de-lipidated fetal bovine serum in bloodstream forms, suggesting that lipids can replace the deficiency generated by the lack of leucine catabolism. Furthermore, the mevalonate was able to restore the growth of procyclic forms. We then, analyzed the steroid content in the parasite after knockdown of the 3-MGCoA-H in different concentrations of leucine. We detected that knockdown parasites growth with an excess of leucine, showed lower amounts of lipid droplets, reduced levels of ergosterol in relation to cholesterol, which is normally scavenged from the serum by the parasite. These results suggest that the downregulation of leucine catabolism affects the mevalonate pathway and consequently, the ergosterol biosynthesis. This could occur by the accumulation of leucine catabolites complexed with CoA, affecting the CoA pool, or directly by direct inhibition of specific enzmes such as the HMGR. These effects could explain why humans with 3-methylglutaconic aciduria type I due to mutations in the 3-MGCoA-H exhibit neurological deficits.

O Trypanosoma brucei é o parasita causador da Tripanossomíase Africana. Este parasita é um protozoário flagelado que se desenvolve em moscas Tsé-tsé e no sangue e sistema linfático de diversos mamíferos causando a doença do sono em humanos e Nagana em ungulados. Para isto o parasita obtém nutrientes como açúcares, lipídeos e aminoácidos de seus hospedeiros. Os aminoácidos são utilizados na produção de energia e também para a síntese proteica e formação de lipídeos. Porém, não se sabe como T. brucei utiliza diversos aminoácidos, entre eles os de cadeia ramificada como leucina, isoleucina e valina. Nesta tese estudamos o papel da via de degradação da leucina que em, T. brucei, é incorporada via formação de mevalonato na síntese de ergosterol, um esterol essencial para este organismo. Assim, caracterizamos a enzima 3-metilglutaconil Coenzima A hidratase (3-MGCoA-H), que gera 3-hidroximetilglutaril Coenzima A (3-HMGCoA) o qual, por sua vez, pode ser utilizado para a formação mevalonato pela ação da 3-hidroximetilglutaril CoA redutase (HMGR). Para isto detectamos o gene, a expressão e atividade enzimática da 3-MGCoA-H no T. brucei. Verificamos que a enzima é um dímero que se localiza na matriz mitocondrial e é expressa tanto nas formas de inseto como nas sanguícolas do parasita. A diminuição da expressão da enzima através de RNA de interferência (RNAi) afetou minimamente a proliferação das formas de inseto, e não teve efeito nas formas sanguícolas. Entretanto, a adição de excesso de leucina fez com que ambas as formas proliferassem menos quando a enzima foi menos expressa. A inibição de crescimento com excesso de leucina pode ser restaurada por soro fetal bovino, mas não por soro fetal bovino delipidado nas culturas da forma sanguínea. Por outro lado, mevalonato pode restaurar o crescimento das formas de inseto. Como o mevalonato é precursor de isoprenóides, que dá origem ao ergosterol, analisamos os esteróides no parasita após RNAi da 3-MGCoA-H. Detectamos que os parasitas induzidos para RNAi apresentaram menores quantidades de corpos lipídicos e níveis reduzidos de ergosterol em relação ao colesterol, que é obtido do soro pelo parasita, sugerindo que o impedimento da degradação da leucina afeta a síntese de ergosterol. Estes resultados indicam que o acúmulo de metabólitos de leucina poderia ou impactar o pool de CoA devido ao acúmulo de intermediários do catabolismo de leucina a, ou diretamente inibindo a formação de mevalonato pela inibição da HMGR. Estes efeitos poderiam também ocorrer em humanos com aciduria 3-metilglutacônica do tipo I que tem mutações na 3-MGCoA-H, que apresentam deficiências neurológicas.
Keywords trypanosoma brucei
mevalonate
3-hydroxymethylglutaryl coenzyme a (3-hmg)
trypanosoma brucei
mevalonato
hidroximetilglutaril coenzima a (3-hmgcoa)
Language Portuguese
Date 2016-02-29
Published in LIMA, Mariana Leao de. Estudo da 3-metilglutaconil coa hidratase da via de degradação de leucina de trypanosoma brucei. 2016. 98 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
Research area Microbiologia
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 98 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4234725
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47992

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