Pvalb: análise do efeito da expressão ectópica em linhagens de carcinoma da tiroide

Pvalb: análise do efeito da expressão ectópica em linhagens de carcinoma da tiroide

Author Mendes, Thais Biude Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Cerutti, Janete Maria Cerutti Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biologia Estrutural e Funcional
Abstract Our group identified a panel of molecular markers (C1orf24, ITM1 and PVALB) that can accurately distinguish between benign and malignant thyroid lesions. Despite the fact that the identification of these new markers may ultimately help patient care, the current understanding of their biological functions remains largely unknown. PVALB stains specifically the benign Hürthle cell adenoma (HCA), while tests negative in a wider variety of thyroid carcinomas including Hürthle cell carcinoma (HCC). As its expression is lost during tumor progression, in this study we ectopically expressed PVALB in two thyroid carcinoma cell lines (FTC-133 and WRO) and dissected the mechanism underlying the phenotypic changes commonly observed in Hürthle cell tumors. We demonstrated that PVALB sequesters free cytoplasmic Ca2+, which ultimately lowers calcium levels and precludes endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ refilling, therefore, inducing ER stress through PERK signaling, as well as compromising the flow of Ca2+ into the mitochondria. By investigating mitochondrial morphology and membrane potential, we demonstrated that PVALB promotes an increase in mitochondrial mass and cell size, in parallel with changes in mitochondrial morphology. Furthermore, PVALB ectopic expression diminished cell proliferation rate and induced cell death through the AKT/GSK-3? pathway. We further demonstrated by immunohistochemistry that PVALB expression colocalizes with the presence of Ca2+ in HCA samples and, therefore, our in vitro results show striking similarities with the results obtained from the analysis performed in Hürthle tumors sections. In summary, PVALB plays a role in cellular calcium homeostasis, ER stress and cell death, most likely related to its role in mitochondrial dynamics. These data support the hypothesis that the loss of PVALB plays a role in the progression of thyroid tumors, predominantly in HCC, and therefore, it may act as a tumor suppressor gene.

O gene PVALB foi identificado pelo nosso grupo como um marcador de benignidade capaz de auxiliar o diagnóstico diferencial dos nódulos da tiroide, pois sua expressão encontra-se aumentada nos adenomas de Células de Hürthle (ACH), mas foram consistentemente negativas nos casos de Carcinomas Foliculares da Tiroide (CFT) Carcinomas de Células de Hürthle (CCH) e carcinomas papilíferos da Tiroide (CPT). O gene PVALB codifica uma proteína quelante de cálcio (Ca2+), cujo papel na gênese dos tumores da tiroide é desconhecido. Neste estudo, propomos caracterizar o papel de PVALB na patogênese dos tumores da tiroide. Para isso, o gene PVALB foi clonado em vetor de expressão fusionado a tag HA (HA-PVALB). Após transfecção permanente do vetor em duas linhagens celulares derivadas de carcinoma folicular da tiroide (WRO e FTC-133), e que não apresentam expressão endógena deste gene, avaliamos os efeitos biológicos e bioquímicos da expressão de PVALB nestas células. Utilizando indicadores específicos de Ca2+ livre Fluo-4, AM (citoplasma) e Rhod-2, AM (mitocôndria), avaliamos o fluxo de cálcio intracelular, após tratamento com tapsigargina, um inibidor seletivo da Ca2+-ATPase do retículo (SERCA). Posteriormente, avaliamos a morfologia das células por Microscopia Eletrônica de Transmissão. Para o potencial de membrana mitocondrial e a distribuição celular das mitocôndrias bem como a massa mitocondrial, utilizamos marcador fluorescente (MitoTracker red CMXRos). As imagens foram avaliadas por microscopia confocal. Também avaliamos os efeitos da expressão ectópica de PVALB nas taxas de proliferação, apoptose e senescência celular. Os níveis de proteínas de possíveis vias de sinalização relacionadas ao efeito biológico da expressão de PVALB foram analisadas por Western Blot. Posteriormente verificamos se a expressão de PVALB, nas amostras de tumores da tiroide está correlacionado com depósito de cálcio na células tumorais. Observamos que PVALB reduz as taxas de Ca2+ livre no citoplasma e na mitocôndria das células WRO. PVALB promove alteração no tamanho das células e na morfologia, número e distribuição das mitocôndrias no citoplasma das da células WRO e FTC-133. Além disso, a expressão de PVALB induziu a expressão de proteínas associadas ao estresse de retículo, bem como, reduziu a expressão de proteínas associas a via PI3K/AKT. Estes dados explicam, em parte, o efeito de PVALB na redução das taxas de proliferação celular e um aumento nas taxas de apoptose ou senescência. Ainda a expressão de PVALB está correlacionada com a presença de cálcio nas amostras de ACH, confirmando nossos resultados obtidos in vitro. Os dados sugerem que PVALB pode atuar como um gene supressor tumoral. A perda da expressão de PVALB nos carcinomas de tiroide pode representar um importante mecanismo associado a gênese e/ou progressão dos tumores da tiroide, especialmente os CCH.
Keywords thyroid neoplasms
calcium
gland thyroid
neoplasias da glândula tireoide
cálcio
glândula tireoide
Language Portuguese
Date 2016-03-31
Published in MENDES, Thais Biude. Pvalb: análise do efeito da expressão ectópica em linhagens de carcinoma da tiroide. 2016. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
Research area Biologia geral
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3587750
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47960

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