Aplicação do método de interferência de rna na caracterização do papel do receptor p2x7 na epilepsia do lobo temporal

Aplicação do método de interferência de rna na caracterização do papel do receptor p2x7 na epilepsia do lobo temporal

Author Amorim, Rebeca Padrao Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Fernandes, Maria Jose da Silva Fernandes Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Neurologia - Neurociências
Abstract Introduction: Epilepsy is a serious neurological disease, and temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common type in adults. Hippocampal sclerosis is the major histopathological alteration in ELT. Hippocampal sclerosis can be reproduced in rats following pilocarpine-induced status epilepticus (SE). Pilocarpine, a cholinergic agonist, when injected in high doses, systemically, induces SE which is followed by neuronal death, synaptic reorganization and hyperexcitability, resulting in spontaneous and recurrent seizures. Cell signaling mediated by P2X7 receptors (P2X7R) has been suggested as an important epileptogenic mechanism. P2X7R activation has been associated with increased intracellular calcium, excitotoxicity, inflammation cascades activation and cell death. Aims: To standardize the RNA interference (RNAi) method to study the in vivo silencing of P2X7R and its role in epileptogenesis using the pilocarpine model. Methods: To standardize small interfering RNA (siRNA) was used a fluorescent oligonucleotide (BLOCK-ITTM), administered by three pathways: intranasal, tail intravenous and intra-hippocampal (ih). The BLOCK-ITTM was complexed to the transfection agent RVG-9dR. The P2X7R knockdown was studied measuring the protein level by western blot. Neuronal death was assayed by Fluoro-Jade B (FJ-B) in brain slices of rat after ih and intracerebroventricular (icv) P2X7R siRNA administration. The hippocampal formation and its subregions volume were studied 48 hours after icv RNAi. Behavioral alterations were performed within 60 days after SE induction in animals subjected to pilocarpine model or saline, that received icv RNAi or vehicle (Groups: Saline-Vehicle, Saline-RNA, Pilo-Vehicle and Pilo-RNA). Results: The ih application of BLOCK ITTM:RVG-9dR complex showed the intracellular fluorescence presence in the hippocampal formation. 48 hours after icv administration of siRNA there was lower P2X7R protein level in the hippocampal formation of Saline-RNA (-43%) and Pilo-RNA (-37%) groups than the respective vehicle groups. The P2X7R knockdown reduced the number of FJ-B-stained cells in the CA1 and CA3 regions, increased latency to the first spontaneous seizure, decreased the number of recurrent spontaneous seizures and normalized the volume of hilus, dentate gyrus suprapyramidal granule cells layer, CA1 and CA3. Conclusions: According to these results, we conclude that RNAi in vivo was effective in the P2X7R knockdown in the hippocampal formation and it protects against injury caused by SE, prevents edema, reduces cell death in the hippocampal formation and minimizes the epileptic seizures manifestations.

Introdução: A epilepsia é uma doença neurológica grave, e a epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais comum em adultos. A esclerose hipocampal é a principal alteração histopatológica da ELT. O modelo de epilepsia induzida por pilocarpina reproduz as principais características da ELT. A pilocarpina é um agonista colinérgico que quando administrada por via sistêmica, em altas doses, status epilepticus (SE) e esclerose hipocampal, com reorganização sináptica e hiperexcitabilidade, culminando no aparecimento de crises espontâneas. A sinalização celular mediada pelos receptores P2X7 (P2X7R) tem sido apontada como importante mecanismo envolvido na epileptogênese. A ativação dos P2X7R desencadeia sinalizações celulares que têm sido associadas com aumento de cálcio intracelular, excitotoxicidade, inflamação e morte celular. Objetivos: Padronizar o método de interferência de RNA (RNAi) dos P2X7R in vivo para estudar o papel dos P2X7R no processo de morte celular hipocampal e seu impacto na epileptogênese em animais submetidos ao modelo de epilepsia induzido por pilocarpina. Métodos: Para a padronização do método de silenciamento dos P2X7R no sistema nervoso central (SNC) empregou-se um oligonucleotídeo fluorescente (BLOCK-ITTM), administrado por 3 vias: intranasal, veia caudal e intra-hipocampal (ih). O BLOCK-ITTM foi complexado ao agente de transfecção RVG-9dR. O silenciamento gênico dos P2X7R, obtido com o siRNA foi mensurado pela expressão proteica do receptor por western blot. A morte neuronal hipocampal foi analisada pela técnica de Fluoro Jade-B (FJ-B) em fatias cerebrais de animais com e sem a administração do siRNA para P2X7R via ih e intracerebroventricular (icv). O volume da formação hipocampal e de suas sub-regiões foi medido 48 horas após a RNAi via icv. Análises comportamentais foram realizadas no período de 60 dias após a indução do SE em animais submetidos ao modelo da pilocarpina ou salina, com RNAi ou veículo icv (Grupos: Salina-Veículo, Salina-RNA, Pilo-Veículo e Pilo-RNA). Resultados: A aplicação ih do complexo BLOCK-ITTM:RVG-9dR revelou a presença de fluorescência intracelular na formação hipocampal. Após 48 horas da administração do siRNA icv houve menor expressão dos P2X7R nos animais Salina-RNA (-43%) e Pilo-RNA (-37%) comparados aos respectivos grupos com veículo. O silenciamento dos P2X7R causou redução do número de células marcadas com FJ-B nas regiões de CA1 e CA3, aumento da latência para a primeira crise espontânea, diminuição do número de crises espontâneas recorrentes e normalização do volume do hilo e da camada de células granulares do giro dentado superior, CA1 e CA3. Conclusões: Com base nos resultados, conclui-se que o silenciamento dos P2X7R promove efeito protetor contra as alterações causadas pelo SE, previne o edema, reduz a morte celular na formação hipocampal e minimiza as manifestações das crises epilépticas.
Keywords temporal lobe epilepsy
p2x7 purinergic receptors
rna interference
pilocarpine
hippocampus
epilepsia do lobo temporal
receptores purinérgicos p2x7
interferência de rna
pilocarpina
hipocampo
Language Portuguese
Date 2014-12-30
Published in AMORIM, Rebeca Padrao. Aplicação do método de interferência de rna na caracterização do papel do receptor p2x7 na epilepsia do lobo temporal. 2014. 121 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.
Research area Medicina
Knowledge area Ciências da saúde
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 121 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=1518097
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47932

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