Pesquisa de variantes patogênicas no gene gnal em pacientes com distonia isolada idiopática

Pesquisa de variantes patogênicas no gene gnal em pacientes com distonia isolada idiopática

Author Alves, Camila Oliveira dos Santos Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Aguiar, Patricia Maria de Carvalho Aguiar Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Neurologia - Neurociências
Abstract Introduction: Due to advancement of Next Generation Sequencing technologies, new genes have been identified as dystonia causes. GNAL gene was recently identified and characterized as a new genetic cause represented by the DYT-GNAL (DYT-25) locus. This gene encodes ? subunit of the stimulatory G protein (G?olf) which is highly expressed in striatum, and acts in the signal transduction mediated by D1 dopamine and A2A adenosine receptors. Prevalence of GNAL variants in dystonia was initially reported as 15% in individuals of European ethnicity, which would have made of this gene a common cause of dystonia. However, studies conducted in Asian and European populations reported frequencies below of 2.6%. Therefore, it is necessary to collect more data to determine the prevalence of pathogenic variants in GNAL in patients with dystonia in other populations. Objective: The aim of this study was to standardize the molecular analysis of the GNAL gene by Sanger sequencing technique and investigation of the prevalence of variants in this gene as the cause of dystonia in a group of Brazilian patients. Methods: Ninety-one patients with isolated idiopathic dystonia, negative for mutations in THAP1 and TOR1A genes, were investigated for variants in GNAL by Sanger sequencing. Non-synonymous variants identified in patients were also investigated in 234 chromosomes from healthy individuals and their frequencies were compared to the populational database ExAC (Exome Aggregation Consortium). For in silico analysis the Mutation taster, Polyphen-2, PROVEAN, SIFT and CADD algorithms were used. To verify the degree of conservation of the amino acid throughout evolution the alignment of protein sequences of different species was performed with the ClustalW software. To investigate the pathogenicity of a novel non- synonymous variant identified in a dystonia patient, a functional assay was performed by Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) assay. Results: One novel non-synonymous variant (p.F133L) was identified in a female patient with cervical and laryngeal dystonia since the third decade of life, with no family history. This variant was not found in 234 chromosomes of Brazilian healthy controls and was not described in 63.000 exomes of the public database ExAC. In silico Analysis by Mutation Taster, PROVEAN, Polyphen-2 and CADD algorithms demonstrated that this variant is deleterious, consistent with result of functional analyses of the mutated G?olf protein obtained by BRET assay, which demonstrated that this variant leads to the increase of basal BRET signal and to the decrease of the response elicited by dopamine, demonstrating a considerable impairment of protein function in signal transduction. Conclusion: Pathogenic variants in GNAL are cause of dystonia among Brazilians, and are less frequent than variants in THAP1 and TOR1A (1.09%, 2.6% and 8.8%, respectively). In this group of patients we identified a case with typical phenotype, however, with no family history. The absence of family history does not exclude the genetic cause, as this could be due to a de novo mutation or a gene with incomplete penetrance. We identified a novel variant (p.F133L) and confirmed that it leads to partial loss of function of G?olf related to signal transduction of dopaminergic pathways, which may contribute to the pathophysiology of dystonia. The elucidation of these and of others physiological mechanisms will enable the development of more effective treatments for dystonia.

Introdução: Devido ao avanço nas tecnologias de sequenciamento de última geração, novos genes foram identificados como causa de distonia. O gene GNAL foi recentemente identificado e caracterizado como uma nova causa genética representada pelo lócus DYT-GNAL (DYT25). Esse gene codifica a subunidade ? da proteína G estimulatória (G?olf), que é altamente expressa no estriado, e atua na transdução de sinal mediada pelos receptores D1 de dopamina e A2A de adenosina. A frequência de variantes GNAL em distonia foi inicialmente reportada como 15% em indivíduos de origem européia, o que faria dessa uma causa genética comum. Entretanto, estudos conduzidos nas populações da Europa e Ásia reportaram frequências abaixo de 2,6%. Portanto, é necessário coletar mais dados para determinar a frequência de variantes patogênicas no gene GNAL em portadores de distonia em outras populações. Objetivo: O objetivo desse estudo foi padronizar a análise molecular do gene GNAL pela técnica de sequenciamento Sanger e investigar a frequência de variantes neste gene como a causa de distonia em um grupo de pacientes brasileiros. Métodos: Noventa e um pacientes com distonia isolada idiopática, negativos para mutações nos genes THAP1 e TOR1A, foram investigados para variantes no gene GNAL por sequenciamento Sanger. Variantes não sinônimas foram investigadas em 234 cromossomos de indivíduos saudáveis e suas frequências foram comparadas ao banco de dados populacional ExAC (Exome Aggregation Consortium). Para análise in silico foram utilizados os algoritmos Mutation taster, Polyphen-2, PROVEAN, SIFT e CADD. Para verificar o grau de conservação do aminoácido ao longo da evolução foi realizado o alinhamento das sequências protéicas de diferentes espécies através do software ClutalW. Para investigar a patogenicidade da variante identificada, um ensaio funcional foi realizado pelo método de Transferência de Energia Bioluminescente por Ressonância (BRET). Resultados: Uma variante não sinônima inédita (p.F133L) foi identificada em uma paciente com distonia cervical e laríngea desde a terceira década de vida, sem história familiar. Essa variante não foi encontrada em 234 cromossomos saudáveis brasileiros e não estava descrita em 63.000 exomas do banco público ExAC. Análises in silico pelos algorítmos Mutation Taster, PROVEAN, PolyPhen-2 e CADD demonstraram que essa variante é deletéria, consistente com o resultado da análise funcional da proteína G?olf mutada obtida pelo ensaio BRET, o qual demonstrou que essa variante leva ao aumento do sinal basal do BRET e à diminuição da resposta elicitada pela dopamina, demonstrando um prejuízo considerável da função protéica na transdução de sinais. Conclusão: Variantes patológicas no GNAL são causa de distonia entre brasileiros, e são menos frequentes do que variantes nos genes TOR1A e THAP1 (1,09%, 2,6% e 8,8%, respectivamente). Neste grupo de pacientes, identificamos um caso com fenótipo típico, porém, sem história familiar. A ausência de história familiar não exclui a causa genética, uma vez que, pode se tratar de uma mutação de novo ou de um gene de penetrância incompleta. Identificamos uma nova variante (p.F133L), e confirmamos que a mesma leva à perda parcial da função da G?olf relacionada à transdução de sinal de vias dopaminérgicas, o que pode contribuir na fisiopatologia da distonia. A elucidação destes e de outros mecanismos fisiopatológicos irá possibilitar o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para as distonias.
Keywords dystonia
genetics
gnal
dyt25
gaolf
distonia
genética
gnal
dyt25
gaolf
Language Portuguese
Date 2016-06-30
Published in ALVES, Camila Oliveira dos Santos. Pesquisa de variantes patogênicas no gene gnal em pacientes com distonia isolada idiopática. 2016. 67 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
Research area Medicina
Knowledge area Ciências da saúde
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 67 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3907222
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46677

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