Ação intrácrina da angiotensina ii em células mesangiais: localização subcelular dos receptores at1 e at2 e comunicação mediada por exossomos

Ação intrácrina da angiotensina ii em células mesangiais: localização subcelular dos receptores at1 e at2 e comunicação mediada por exossomos

Author Novaes, Antonio da Silva Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Boim, Mirian Aparecida Boim Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Medicina (Nefrologia)
Abstract Introduction: Currently is discussed the biological relevance of the intracellular renin angiotensin system (RAS) mediating the intracrine actions of angiotensin II (Ang II). The presence of AT1 and AT2 receptors in the intracellular compartment may mediate the nonclassical effects Ang II, including regulation of gene expression of Ang II target genes such as pro-fibrotic cytokines. Intracrine effects of Ang II can be mediated by peptides transfer to other cells via exosomes. Objectives: 1) to evaluate the intracellular distribution of AT1 and AT2 receptors in human mesangial cells (HMC) and its pathophysiological role under stimulus with high glucose concentration (HG); 2) to verify whether exosomal signaling initiated in HCM is responsive to HG stimulus. Methods: The distribution of AT1 and AT2 like receptors was determined by immunofluorescence in whole cell and in intact isolated nuclei. Molecular weight (MW) of both receptors were confirmed by Western blotting (WB) of nuclear extract proteins. Intracellular synthesis of Ang II was stimulated by HG and the intracrine effect of Ang II was analyzed on fibronectin gene expression in the presence and absence of candesartan which discriminates the intra and extracellular effects of Ang II. The exosomal contents of angiotensinogen and renin were analyzed by Western Blotting. Exosomes obtained from control (C-Ex) and HG exposed HMC (HG-Ex) were used to evaluate whether they are able to modify the function of target control HMC on expressions of fibronectin, angiotensinogen, renin, AT1, AT2 and proliferation. Results: AT1 and AT2 were found in whole cell including nuclear membrane and in the membrane of the isolated nuclei. WB analysis confirmed the MW of both receptors in nuclei. Labelled exogenous Ang II bound to nuclear membrane. HG stimulated cells presented higher levels of fibronectin and this effect was not inhibited by candesartan, suggesting an intracellular effect of Ang II. HG stimulus induced a change in the amount, but not in the size of exosomes. Exosomes derived from control HMC contained angiotensinogen and renin proteins, which expression were increased in the exosomes obtained from HMC stimulated by HG. The expression levels of fibronectin and angiotensinogen were higher in control HCM treated with HG-Ex compared with those treated with C-Ex, indicating that HG-Ex can modify the function of normal HMC. Conclusion: Nuclear AT1 and AT2 receptors are active in cultured HMC. The exosomes derived from HG stimulated HMC modified the function of target control cells, suggesting that the intercellular communication through the exosomes may have pathophysiological implications in the diabetic kidney.

Introdução: Atualmente é discutida a relevância biológica do sistema reninaangiotensina (RAS) intracelular, responsável pela ação intrácrina da angiotensina II (Ang II). A presença dos receptores AT1 e AT2 no compartimento intracelular pode mediar efeitos não clássicos da Ang II, incluindo a regulação da expressão de genes alvo de Ang II, tais como citocinas pró-fibróticas. Os efeitos intrácrinos da Ang II podem ser mediados por transferência de peptídeos para outras células via exossomos. Objetivos: 1) avaliar a distribuição intracelular dos receptores AT1 e AT2 em células mesangiais humanas (CMH) e seu papel fisiopatológico no estímulo com alta concentração de glicose (AG); 2) testar a hipótese de que a sinalização exossomal pelas CMH é responsiva AG. Metodologia: A distribuição dos receptores AT1 e AT2 foi determinada por imunofluorescência em CMH intactas e em núcleos isolados. O peso molecular (PM) de ambos os receptores foi confirmado por Western Blotting (WB) em extrato proteico nuclear. A síntese intracelular de Ang II foi estimulada por AG e o efeito intrácrino da Ang II foi analisado na presença ou ausência de candesartan o qual discrimina os efeitos intra e extracelular da Ang II. O conteúdo exossomal de angiotensinogênio e renina foi analisado por WB. Exossomos obtidos de CMH controle (Ex-C) ou CMH estimuladas por AG (Ex-AG) foram usados para avaliar sua capacidade de modificar a função de CMH controle alvo. A expressão gênica (fibronectina e AGT), e proteica (AGT, renina, AT1, AT2), e a proliferação celular foram utilizadas para avaliar a funcionalidade da CMH. Resultados: AT1 e AT2 foram encontrados na membrana nuclear da CMH e em núcleos isolados. A análise por WB confirmou o PM de ambos os receptores. Ang II exógena marcada ligou-se a membrana nuclear. As células estimuladas por AG apresentaram níveis elevados de fibronectina e este efeito não foi inibido pelo candesartan, sugerindo um efeito intrácrino. O estímulo com AG induziu uma alteração na quantidade, mas não no tamanho dos exossomos. Exossomos derivados de CMH continham AGT e renina, e este conteúdo foi aumentado nos exossomos obtidos de CMH estimuladas por AG. A expressão de fibronectina, AGT renina, AT1 e AT2 foram maiores em CMH controle tratadas com Ex-AG comparada com Ex-C, indicando que os Ex-AG podem modificar a função de CMH normais. Conclusão: Os receptores AT1 e AT2 são ativos em CMH em cultura. Os exossomos derivados de CMH estimuladas com AG modificaram a função de CMH controle alvo, sugerindo que a comunicação intercelular através dos exossomos pode ter implicações fisiopatológicas na nefropatia diabética.
Keywords at1 receptor
at2 receptor
exosomes
mesangial cells
receptores at1
receptores at2
exossomos
células mesangiais
Language Portuguese
Date 2016-12-31
Published in NOVAES, Antonio da Silva. Ação intrácrina da angiotensina ii em células mesangiais: localização subcelular dos receptores at1 e at2 e comunicação mediada por exossomos. 2016. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
Research area Medicina
Knowledge area Ciências da saúde
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4697551
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46276

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