Atividade imunomodulatória da arazima sobre células dendríticas e sua utilização no modelo de adenocarcinoma de mama murino 4t1

Atividade imunomodulatória da arazima sobre células dendríticas e sua utilização no modelo de adenocarcinoma de mama murino 4t1

Author Melo, Amanda Campelo Lima de Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Rodrigues, Elaine Guadelupe Rodrigues Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Microbiologia e Imunologia
Abstract Breast cancer is the third most frequent type of cancer in the world and in developing countries is the second leading cause of death in women. Although surgical removal of the primary tumor is the main therapy, metastatic disease is still very common, and available treatments are ineffective in this condition. Alternative therapies using plant, animal or bacterial proteolytic enzymes have been evaluated in several diseases, and enzymes like fastuosain, bromelain, trypsin, papain and chymotrypsin have been tested experimentally and clinically for cancer treatment. However, the molecular mechanism of these proteases has not yet been fully elucidated. Arazyme is a bacterial metalloprotease isolated from Serratia proteomaculans, living in symbiosis with Nephila clavata spider. Previous studies in our laboratory showed that arazyme significantly reduced the number of metastatic lung nodules after endovenous inoculation of murine melanoma B16F10-Nex2 cells; however the protease showed no effect on the development of primary tumors, obtained after subcutaneous inoculation, in the tested conditions. Arazyme showed a direct cytostatic effect on tumor cells, with the cleavage of adhesion molecules (CD44) on cell surface, and also induction of protease-specific immunoglobulins that cross-react with tumor MMP8. But metastatic tumor control was also due to a potent immunomodulatory effect of arazyme, that activated antigen-presenting cellsto induce an IFN-?-dependent, tumor-specific immune response thatdoes not require the proteolytic activity of the protease. Based on these results, the aim of this study was to evaluate a possible antitumor effect of this bacterial metalloprotease in 4T1 murine mammary adenocarcinoma model, in which tumor metastasis occur naturally from primary tumor. We also aimed to determine the signaling pathways used by arazyme to activate antigen presenting cells. Our results showed that heat-inactivated arazyme has an antitumor effect on murine breast carcinoma, reducing primary tumor volumes as well as the number of pulmonary metastases, increasing significantly survival of treated-animals. This effect was dependent on an intact immune system, sincethe effect was abolished on immunosuppressed animals. Dendritic cells treated ex vivo with active or inactive arazyme showed a higher expression of co-stimulatory molecules (CD80 and CD86) on their surface, and an increased production of proinflammatory cytokines (IL-12 and IL6). DCs activated by arazyme were able to activate naive T lymphocytes in vitro, showed by increased concentrations of IFN-? in the co-culture supernatant. Vaccination of mice with dendritic cells pulsed with tumor lysate and treated ex vivo with arazyme induced an antitumor response, which completely abrogated tumor development. Immunohistochemistry assays showed a reduced number of regulatory T cells in the pulmonary metastasis microenvironment of arazyme-treated animals. Our results showed that activation of myeloid cells by active / inactive arazymewas dependent on the TLR4/MyD88/TRIF signaling pathway, with participation of MAPK pathway. In summary, arazymehas a potent immunomodulatory effect independent of the proteolytic activity, dependent on the TLR4/MyD88/TRIF/MAPK signaling pathway, that is able to induce an antitumor protective response on different experimental tumor models.

O câncer de mama é o terceiro tipo de câncer mais frequente no mundo e em países em desenvolvimento é a segunda causa de morte em mulheres. Embora a principal terapia para este tipo de câncer seja a remoção cirúrgica do tumor primário, a doença metastática é ainda muito frequente, e poucos tratamentos disponíveis demonstram ser totalmente efetivos nessa condição. O uso de enzimas proteolíticas de origem animal, vegetal ou bacteriana como alternativas terapêuticas tem sido analisado em diversas doenças, e várias delas, como a fastuosaína, bromelaína, tripsina, papaína, quimiotripsina entre outras, já foram testadas experimentalmente e também em alguns ensaios clínicos no tratamento do câncer. No entanto, o mecanismo de ação molecular destas proteases ainda não foi totalmente elucidado. A arazima é uma metaloprotease isolada da bactéria Serratia proteamaculans, simbionte da aranha Nephila clavata. Estudos realizados em nosso laboratório mostraram que arazima reduziu significativamente o número de nódulos pulmonares metastáticos no modelo de melanoma murino B16F10-Nex2, gerados por inoculação endovenosa das células,embora não tenha apresentado efeito sobre o desenvolvimento do tumor primário, gerado por inoculação subcutânea, nas condições testadas. A arazima apresentou um efeito citostático direto sobre o tumor, com clivagem de moléculas de adesão (CD44) presentes na superfície das células tumorais, em associação com a indução de anticorpos protease-específicos que reagem cruzadamente com MMP8 tumoral, mas também e principalmente, devido a um potente efeito imunomodulador que ativoucélulas apresentadoras de antígenos, induzindo uma resposta antitumoral celular e humoral IFN-?-dependente e tumor-específica e que não requer a atividade proteolítica da arazima. Com base nesses resultados, o objetivo deste estudo foiavaliar um possível efeito antitumoral dessa metaloprotease bacteriana no modelo de adenocarcinoma mamário murino 4T1, onde a metástase tumoral ocorre de maneira natural a partir do tumor primário, e também a determinação da via de sinalização utilizada pela arazima para ativação celular. Nossos resultados demonstraram que a arazima inativa possui um efeito antitumoraltambém no modelo de carcinoma de mama murino, reduzindo não só o volume do tumor primário como também o número de metástases pulmonares, promovendo um aumento significativo na sobrevida dos animais tratados. Esse efeito foi dependente de um sistema imune intacto, uma vez que não se observou o mesmo (CD80 e CD86) na sua superfície, uma maior produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12 e IL-6), e foram funcionais in vitro, ativando linfócitos T naive, o que levou a um aumento na concentração de IFN-? no sobrenadante da co-cultura das duas células. A transferência de células dendríticas pulsadas com lisado tumoral e tratadas com arazima ex-vivo induziu uma resposta antitumoral, que inibiu completamente o aparecimento do tumor nos animaist tratados. Ensaios de imunohistoquímica mostraram que os pulmões dos animais tratados com arazima apresentaram menor número de células T reguladoras no microambiente tumoral quando comparados aos animais não tratados. Nossos resultados demonstraram também que a ativação de células mielóides pela arazima ativa/inativaocorre por uma via de sinalização dependente de TLR4/MyD88/TRIF,com a participação da via de MAPK. Em resumo, aarazima apresenta um potente efeito imunomodulador, independente da sua atividade proteolítica, e dependente da ativação da via de sinalização TLR4/MyD88/TRIF/MAPK, capaz de induzir resposta antitumoral eficaz em diferentes modelos de tumores experimentais.
Keywords adenocarcinoma de mama 4t12
toll-like receptor 4
adenocarcinoma de mama 4t12
toll-like receptor
Language Portuguese
Date 2014-09-30
Published in MELO, Amanda Campelo Lima de. Atividade imunomodulatória da arazima sobre células dendríticas e sua utilização no modelo de adenocarcinoma de mama murino 4t1. 2014. 76 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.
Research area Microbiologia
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 76 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=1957046
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46145

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