Avaliação da produção de citocinas inflamatórias apos estimulação por lipoproteína L32(LipL32), lipopolissacarídeo (LSP) e lipopeptídeo ativador de monócitos-2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em monócitos de pacientes com leptospirose

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias apos estimulação por lipoproteína L32(LipL32), lipopolissacarídeo (LSP) e lipopeptídeo ativador de monócitos-2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em monócitos de pacientes com leptospirose

Título alternativo Production of inflammatory cytokines after lipoprotein L32 (LipL32), lipopolysaccharide (LPS) and macrophage-activating lipopeptide-2 (MALP-2) stimulation and evaluation of superficial receptors expression on monocytes of infected patients with leptospirosis
Autor Pavanelli, Tais Francisco Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Salomão, Reinaldo Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Infectologia - São Paulo
Resumo A leptospirose constitui uma importante zoonose, encontrada em regiões de clima tropical, ocorrendo principalmente em épocas chuvosas. O controle da infecção depende do adequado reconhecimento do microorganismo pelos receptores de reconhecimento de padrão de patógenos, os TLRs, presentes nas células do sistema imune inato do hospedeiro. A ativação dos TLRs é fundamental para o desencadeamento da resposta inflamatória, mediadora da resposta de proteção e de lesão no processo infeccioso. Objetivos: Avaliar a expressão dos receptores TLR2, TLR4 e CD14 na superfície de monócitos e a resposta in vitro aos estímulos LipL32 (extraído de Leptospira sp.), MALP-2 (antígeno sintético de Mycoplasma fermentans) e LPS (antígeno extraído de Salmonella abortus equi) ligantes dos TLRs, medida pela produção de citocinas, em pacientes com leptospirose. Métodos: Foram incluídos 07 pacientes com quadro clínico e laboratorial de leptospirose e 07 voluntários sadios, utilizados como controle. As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram separadas utilizando ficoll-paque, congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido. Após descongelamento, verificação da viabilidade e acerto da concentração de células para 1x106 células/mL foi mensurada a expressão de TLR2, TLR4 e CD14 na superfície de monócitos. O restante da suspensão de células foi incubada por 6 horas com os estímulos de 1000ng/mL de LipL32, 0,4U/mL de MALP-2 ou 100ng/mL de LPS. Após a primeira hora de incubação foi adicionado monensina para bloqueio da secreção de citocina. Em seguida, as CMSP foram marcadas com CD14, fixadas, permeabilizadas e expostas aos anticorpos anti-IL-6 e anti-TNF-α para detecção intracelular da produção destas citocinas inflamatórias nos monócitos. Foram adquiridos 10.000 eventos combinado-se morfologia e positividade para CD14 em citometria de fluxo. Resultados: Não foi observada diferença significativa na resposta inflamatória entre pacientes com leptospirose e voluntários sadios quando CMSP foram estimuladas in vitro com MALP-2 e LipL32 para indução da produção de citocinas inflamatórias (IL-6 e TNF-α) em monócitos. Todavia, a produção de TNF-α foi menor após estímulo com LPS (p=0,035), o que não ocorreu com a produção de IL-6. Em relação à expressão de receptores de superfície, foi observado aumento da expressão de TLR2 (p=0,025) na superfície de monócitos dos pacientes, porém não houve diferença na expressão de TLR4 e CD14. Conclusões: Neste estudo demonstramos que a capacidade de reconhecimento de antígenos pelos monócitos do sangue periférico de pacientes com leptospirose está preservada ou aumentada. Além disso, observamos que a produção de citocinas inflamatórias frente a antígeno da própria Leptospira (LipL32) e outro antígeno agonista de TLR2 (MALP-2) está mantida. Entretanto, a produção de citocina inflamatória frente ao LPS (agonista de TLR4) mostrou-se complexa podendo estar influenciada pela tolerância cruzada.

The Leptospirosis is one of the world's most important zoonoses, found in regions of tropical climate, occurring mainly in rainy seasons. The control of infection depends on the proper recognition of the microorganism by receptors for recognition of patterns of pathogens, the TLRs present in the cells of the innate immune system of the host. The activation of TLRs is crucial for triggering the inflammatory response, mediator of the response of protection in case of injury and infection. Objectives: To evaluate the expression of receptors TLR2, TLR4 and CD14 on the monocytes surface in vitro and response to stimuli LipL32 (extracted from Lestospira sp.), MALP-2 (synthetic antigen of Mycoplasma fermentans) and LPS (antigen extracted from bacteria-gram negative) binders of TLRs, as measured by production of cytokines in patients with leptospirosis. Methods: 07 patients with clinical and laboratory of leptospirosis were included and 07 healthy volunteers, used as controls. The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated using ficoll-paque, frozen and stored in liquid nitrogen. After thawing, checking the feasibility and wisdom of the concentration of cells to 1x106 células/mL was measured the expression of TLR2, TLR4 and CD14 on the monocytes surface. The rest of the cell suspension was incubated for 6 hours with the stimuli of 1000ng/mL of LipL32, 0.4 U / mL of MALP-2 or 100ng/mL of LPS. After the first hour of incubation was added monensin for blocking the secretion of cytokine. Then the PBMC were stained with CD14, set, permeabilizaded and exposed to anti-IL-6 and anti-TNF-α for detection of intracellular production of inflammatory cytokines in monocytes. They were acquired 10,000 events combined to morphology and positive for CD14 in flow cytometry. Results: There was no significant difference in the inflammatory response among patients with leptospirosis and healthy volunteers when PBMC were stimulated in vitro with MALP-2 and LipL32 to induce the production of inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) in monocytes. However, the production of intracellular of TNF-α was lower after stimulation with LPS (p = 0035), which did not occur to the production of IL-6. Regarding the expression of surface receptors, it was observed increased expression of TLR2 (p = 0025) on the monocytes surface of patients, but there was no difference in the expression of TLR4 and CD14. Conclusions: This study demonstrated that the ability of recognition of antigens by peripheral blood monocytes of patients with leptospirosis is preserved or increased. Also, we observed that the production of inflammatory cytokines in front of the Leptospira antigen (LipL32) and another antigen agonist of TLR2 (MALP-2) is maintained. Meanwhile, the production of inflammatory cytokine front of LPS (agonist of TLR4) proved to be complex may be influenced by cross tolerance.
Palavra-chave Leptospirose
Monócitos
Lipoproteínas
Citocinas
Imunofenotipagem
Citometria de Fluxo
Idioma Português
Data de publicação 2008
Publicado em PAVANELLI, Tais Francisco. Avaliação da produção de citocinas inflamatórias apos estimulação por lipoproteína L32(LipL32), lipopolissacarídeo (LSP) e lipopeptídeo ativador de monócitos-2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em monócitos de pacientes com leptospirose. 2008. 128 p. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2008.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 128 p.
Direito de acesso Acesso aberto Open Access
Tipo Dissertação de mestrado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/24401

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Nome: Publico-24401.pdf
Tamanho: 1.099MB
Formato: PDF
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