Expressão de um gene codificador de cisteína proteinase de Leishmania(Leshmania) amazonensis em sistema bacteriano e avaliação das respostas imunes induzidas pela proteína recombinante em modelo murino

Abstract

O enfoque do nosso trabalho foi avaliar a antigenicidade de uma cisteína proteinase recombinante de Leishmania (Leishmania) amazonensis e a capacidade protetora desse antígeno contra a infecção homóloga em camundongos BALB/c. Um fragmento de 500 pb do gene Lacys24, codificador de uma isoforma de cisteína proteinase de L. (L.) amazonensis previamente clonado em nosso laboratório, foi subclonado e expresso no vetor bacteriano pHis, originando uma proteína recombinante de 24 kDa, rLacys24. Por experimentos de “Western blotting” foi demonstrado que anticorpos produzidos contra essa proteína reconhecem uma banda de 30 kDa do extrato de amastigotas de L. (L.) amazonensis, indicando que a rLacys24 corresponde a uma isoforma de cisteína proteinase de 30 kDa abundantemente expressa nesses parasitas. A antigenicidade da rLacys24 foi avaliada pela análise das populações de linfócitos dos camundongos BALB/c previamente imunizados com a proteína recombinante mais Propionibacterium acnes ou adjuvante completo de Freund (ACF) como adjuvantes. A análise por citometria de fluxo dos linfócitos provindos dos linfonodos inguinais e poplíteos dos animais imunizados com a rLacys24 + ACF por via subcutânea mostrou um aumento significante da expressão de linfócitos CD8+ comparada à dos controles que receberam apenas ACF. Quanto à CD4+ , não houve diferença na expressão dessa população de linfócitos entre os controles e os animais imunizados com a rLacys24. Por outro lado, foi baixa a expressão de linfócitos CD4+ e CD8+ no baço dos camundongos imunizados com a rLacys24 + P. acnes pela via intraperitoneal. O ensaio de citotoxicidade dos linfócitos dos camundongos imunizados com a rLacys24 + ACF foi realizado utilizando-se como células-alvo macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis. A lise dos macrófagos infectados na presença dos linfócitos dos animais imunizados com a rLacys24 foi significantemente maior que a observada quando as células-alvo foram incubadas com os linfócitos dos animais controle. A imunização ativa dos camundongos BALB/c com a rLacys24 + ACF resultou em pequeno, porém significante decréscimo das lesões das patas dos animais após o desafio com a L. (L.) amazonensis, enquanto que nos animais imunizados com a rLacys24 + P. acnes as lesões apresentaram aumento gradativo até três meses após o desafio. No outro esquema de imunização avaliado, os animais foram imunizados com a cisteína proteinase de amastigotas de L. (L.) chagasi, rLdccys, além da rLacys24, e P. acnes como adjuvante e desafiados com a L. (L.) amazonensis. A avaliação das respostas imunes dos animais imunizados foi realizada por citometira de fluxo e pela detecção por ELISPOT de IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas culturas dos linfócitos dos animais três meses após o desafio. Em todos os animais imunizados houve predomínio da expressão de linfócitos CD4+ , enquanto que a dos linfócitos CD8+ foi baixa (em torno de 8-10%). IFN-γ foi secretado pelos linfócitos isolados de todos os animais estudados, não tendo havido diferenças significantes na secreção dessa linfocina entre os animais imunizados com os antígenos recombinantes e os controles que receberam apenas a P. acnes. Enquanto IL-10 não foi detectada nas culturas de linfócitos de nenhum dos animais imunizados, IL-4 foi secretada pelos linfócitos de todos os animais estudados. Entretanto, a expressão da IL-4 foi significantemente menor nas culturas de linfócitos dos animais imunizados com os antígenos recombinantes comparada à dos controles. Não foram observadas diferenças do tamanho das lesões das patas dos camundongos imunizados com os antígenos recombinantes em relação aos controles, sendo esses resultados confirmados quando a infecção dos animais foi avaliada pelo crescimento em meio axênico dos parasitas isolados das lesões. Apesar da reduzida proteção conferida pela rLacys24, os dados do presente trabalho sugerem que esse antígeno pode ser útil em novos esquemas de imunização que induzam respostas mediadas por linfócitos CD4+ e CD8+ mais eficazes contra a infecção pela L. (L.) amazonensis.

Our work focused on the antigenicity of a recombinant cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) amazonensis and on the protective role of this antigen in the infection of BALB/c mice with the parasite. A 500 bp fragment from the Lacys24 gene, encoding an isoform of cysteine proteinase from L. (L.) amazonensis previously cloned in our laboratory, was subcloned and expressed in the pHis vector, resulting in a recombinant protein of 24 kDa, rLacys24. In Western blots of L. (L.) amazonensis extracts, antibodies directed to the rLacys24 antigen recognized a 30 kDa band identified as an isoform of cysteine proteinase abundantly expressed in these parasites. The antigenicity of the rLacys24 was evaluated by analysis of the T lymphocyte profile in BALB/c mice previously immunized with this recombinant protein plus either Propionibacterium acnes or Freund’s complete adjuvant (CFA). Lymphocytes isolated from the popliteal and inguinal lymph nodes of animals immunized with rLacys24 plus CFA by the subcutaneous route were analysed by fluorescence-activated cell sorter (FACS). A significantly higher expression of CD8+ lymphocytes was observed in animals immunized with rLacys24 plus CFA compared to the controls which received CFA alone. In contrast, a low expression of CD4+ lymphocytes was observed in these animals. On the other hand, the expression of CD4+ and CD8+ lymphocytes there was lower in spleens from animals immunized with rLacys24 plus P. acnes by intraperitoneal route. The cytotoxicity of lymphocytes isolated from mice immunized with rLacys24 plus CFA was assyed by use of L. (L.) amazonensis-infected macrophages as the target cells. The cytotoxicity of lymphocytes from rLacys24-immunized mice was significantly higher than that observed when the target cells were incubated with lymphocytes from control animals. Active immunization of BALB/c mice with rLacys24 plus CFA resulted in a low but significant decrease of foot lesions after challenge with L. (L.) amazonensis in comparison with the lesion size in control mice. In contrast, there was a similar increase of foot lesions among mice immunized with rLacys24 plus P. acnes or with P. acnes alone. In another immunization protocol, animals were immunized with a recombinant cysteine proteinase from L. (L.) chagasi, rLdccys1, besides rLacys24, plus P. acnes as the adjuvant. Immune responses were evaluated by FACS and ELISPOT for detection of IFN-γ, IL-4 and IL-10 in lymphocyte cultures from animals three months after challenge with L. (L.) amazonensis. All of the immunized animals showed a predominance of T CD4+ lymphocytes and a low expression of CD8+ (8-10%). IFN-γ was secreted by lymphocytes isolated from all immunized animals and there were no significant differences of IFN-γ secretion among animals immunized with the recombinant antigens or with P. acnes alone. IL-10 was not detected in lymphocyte cultures from the immunized animals. However, IL-4 expression was significantly lower in lymphocyte cultures from animals immunized with the recombinant antigens compared to the controls. There were no significant differences in foot lesion size from BALB/c mice immunized with the recombinant antigens compared to the controls; these results were confirmed by estimates of parasites isolated from the foot lesions. In spite of the low protection conferred by the rLacys24, our data suggest that this recombinant antigen may be useful in new immunization schedules aiming to elicit more efficient CD4+ and CD8+ protective responses against L. (L.) amazonensis infection.