Estudo da evolução molecular de sequências de rDNA 18S aplicado à investigação de fatores de patogenicidade do filo Ascomycota

Estudo da evolução molecular de sequências de rDNA 18S aplicado à investigação de fatores de patogenicidade do filo Ascomycota

Título alternativo Study of the molecular evolution of 18S rDNA sequences applied to the investigation of pathogenicity factors of the phylum Ascomycota
Autor Padovan, Ana Carolina Barbosa Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Briones, Marcelo Ribeiro da Silva Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Microbiologia e imunologia - São Paulo
Resumo O tema deste trabalho é estudar alguns fatores importantes de patogenicidade de fungos do Filo Ascomycota e sua correlação com padrões da dinâmica da expressão gênica na perspectiva da Evolução Molecular. Decidimos concentrar nossos esforços iniciais nas questões de sistemática deste grupo, uma vez que a sistemática do Filo Ascomycota, tal como inferida por métodos atuais, apresenta politomias basais, indicando portanto, controvérsias na reconstrução dos eventos de radiação evolutiva de seus principais taxa. A análise molecular descrita neste trabalho sugere a existência de dois grupos na posição basal entre os ascomicetos filamentosos: os Discomycetes e os Pyrenomycetes. Foram propostos dois cenários para os principais eventos de radiação daquele filo, o primeiro localizando os principais eventos na era Proterozóica e o segundo, na era Paleozóica. Para tanto, geramos um alinhamento de 166 seqüências da subunidade menor do gene ribossômico 18S (SSU rDNA 18S), representativas de todos os filos de Fungi e utilizamos como base para uma análise filogenética Bayesiana. A filogenia sugeriu que os Discomycetes são o grupo basal dentre os ascomicetos filamentosos e provavelmente mantém caracteres ancestrais visto que seus representantes estão espalhados entre outros grupos de fungos filamentosos. Verificamos que a taxa evolutiva de heterogeneidade do filo Ascomycota rejeita a hipótese nula de um relógio molecular global. Para datar os principais eventos da radiação deste filo, foi utilizado o método “penalized likelihood”, e para calibração, foram incluídos um fóssil de Pyrenomycete datado em 400 Ma e considerados dois diferentes cenários encontrados na literatura, um com uma data estimada de 1.576 Ma para a separação entre planta-animal-fungo e outro, com data estimada de 965 Ma para a separação entre animal-fungo. Estimativas baseadas no primeiro cenário são mais antigas do que datas propostas em estudos anteriores baseados em seqüências do rDNA 18S, mas corroboram estimativas baseadas em análises de multiproteínas, sugerindo que a radiação dos principais grupos de Ascomycota ocorreu na era Proterozóica. Durante o processo evolutivo, fatores de patogenicidade surgiram dentro do filo Ascomycota e são encontrados em fungos dos grupos Pezizomycetes, Archiascomycetes e na Ordem Saccharomycetales. Candida albicans, o patógeno humano oportunista mais frequentemente isolado, é um representante desta ordem. Sua capacidade de formar biofilmes confere propriedades importantes para processos infectivos e colonização de diversos substratos, sendo ainda muito efetiva na resistência às drogas antifúngicas. A descrição e dinâmica dos componentes moleculares da matriz do biofilme, associados com as mudanças no metabolismo celular, poderiam explicar, pelo menos em parte, as propriedades em macro escala desta importante estrutura. Utilizando espectrometria de massa identificamos a enolase como um dos principais componentes da matriz do biofilme de Candida. Ainda, a presença de enolase na superfície celular foi confirmada por imunofluorescência. Caracteristicamente, por ser uma enzima citosólica que participa da via glicolítica, a enolase não possui sinal de secreção, no entanto, verificamos que a proteína é possivelmente glicosilada e fosforilada. Análises de degradação e recaptação mostraram que a proteína é degradada a 37o C e não é recaptada pela parede celular, sugerindo que exista uma via de secreção não-clássica por onde a enolase possa ser secretada para o biofilme e para a superfície celular sem ser degradada no meio externo. A expressão da enolase (ENO1) e das enzimas da via glicolítica como a hexoquinase, piruvatoquinase e aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 e FBA1) de 14 diferentes linhagens de C. albicans que foram cultivadas em condições de crescimento como biofilme, microaerofilia, hifas e leveduras, não mostraram variação significativa, sugerindo que a condição de crescimento não afeta a expressão desses genes nas diferentes linhagens analisadas. Os genes ALS3 e HWP1 codificadores de adesinas tiveram a expressão diminuída em pelo menos 4 vezes em resposta a diminuição da expressão dos genes TEC1 e BCR1 que controlam a formação biofilme. Este tipo de regulação sugere que mecanismos de “feedforward” possam estar presentes nesta rede regulatória. A principal adesina da parede celular das hifas é Hwp1p, necessária para a formação apropriada de hifas e virulência em candidíase sistêmica. Nós descrevemos um novo alelo de HWP1 (HWP1-2), que não possui três importantes regiões, em comparação com o alelo descrito anteriormente (HWP1-1). As regiões 1 e 2 consistem de 10 aminoácidos repetidos em seqüência, importantes para a conformação funcional de cadeias peptídicas e a adesão das células de C. albicans ao epitélio de mamíferos. A região 3 é composta de 34 aminoácidos que promovem a ligação cruzada com outras proteínas na superfície de C. albicans. As linhagens homozigota para HWP1-2 (L757) e heterozigota (L296) têm níveis significativamente mais baixos na expressão de HWP1 durante a formação de hifas e biofilme, em comparação com a linhagem SC5314 (homozigota para HWP1-1). L757 teve crescimento na forma de hifa reduzido (40,4%) e diminuída a formação de biofilme (90,8%), sugerindo que a Hwp1-2p é menos eficiente para manter a adesão célula-célula e célula-superfície durante a formação do biofilme. Em conjunto nossos resultados mostram que as propriedades patogênicas de fungos não podem ser seriamente estudadas sem uma sólida base em sistemática molecular apoiada, por sua vez, nos métodos explicitamente quantitativos das áreas de Estatística, Teoria de Sistemas Dinâmicos e algoritmos computacionais.

The aim of this work is the study of factors that are important for the pathogenicity of the main fungi within phylum Ascomycota and its correlation with expression patterns on the perspective of Molecular Evolution. We decided to elucidate questions concerning the systematics of this group, since the actual systematics of the Ascomycota phylum is depicted as basal polytomies. The molecular analysis described in this work indicates two groups in the basal position among filamentous ascomycetes: Discomycetes and Pyrenoycetes. Also, two scenarios are proposed for the major radiation events within that phylum, one places the major events in the Proterozoic era and the other, in the Paleozoic era. Accordingly, we generated a dataset of 166 small subunit (18S) rDNA sequences, representative of all groups of Fungi and used as input in a Bayesian phylogenetic analysis. This phylogeny suggests that Discomycetes are a basal group of filamentous ascomycetes and probably maintain ancestor characters since their representatives are intermingled among other filamentous fungi. Also, we show that the evolutionary rate heterogeneity within Ascomycota rejects the null hypothesis of a global molecular clock. To estimates the dates of major radiation events, we used the penalized likelihood method and for calibration we included a 400 My Pyrenomycete fossil. Two distinct scenarios were considered, being, one with an estimated date of 1.576 Myr for the plant–animal–fungus split and the other with an estimated date of 965 Myr for the animal–fungus split. Estimates under the first scenario are older than dates proposed in previous studies based on small subunit rDNA sequences but support estimates based on multiprotein analysis, suggesting that the radiation of the major Ascomycota groups occurred into the Proterozoic era. Pathogenic factors have evolved within Ascomycota and can be found in fungi of Orders Pezizomycetes, Archiascomycetes and Saccharomycetales. Candida albicans, the most frequently isolated human opportunistic pathogen, is representative of this Order. Its ability to form biofilms is a very important factor during the infection process, colonization of several solid substrates and confers significant resistance to antifungal drugs. Components of the biofilm matrix associated with changes in the cellular metabolism could, at least in part, explain its macro-scale properties. We identified that enolase is a major component of the Candida biofilm matrix by using mass espectrometry and confirmed its presence in the cell surface by immunefluorescence. Characteristically of cytosolic enzymes that participate of the glycolytic pathway, enolase does not possess signal for secretion, however, we verified that this protein can be putatively glycosylated and phosphorylated. Degradation and reuptake analyses of enolase demonstrated that it is degraded at 37o C and it is not reuptaked by the cell wall, which suggests that there is a non-classical secretory pathway by where enolase can be sent to the biofilm matrix and the cell surface protected against the external medium degradation. No significant variation in the expression of enolase (ENO1) and glycolytic pathway enzymes hexokinase, pyruvate kinase and aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 and FBA1) were observed among 14 different lineages of C. albicans grown in biofilm, microaerophilia, hyphal induced and yeast induced conditions. Adhesin encoding genes ALS3 and HWP1 showed diminished expression levels (at least 4-fold) in response to the down regulation of biofilm control genes TEC1 and BCR1. This suggests that expression levels of ALS3 and HWP1 can be regulated by feedforward mechanisms. The major C. albicans hyphae cell wall adhesin, Hwp1p, is necessary for hyphae formation and virulence in systemic candidiasis. We described a novel HWP1 allele (HWP1-2) lacking three important regions as compared to the previously described allele, HWP1-1. Regions 1 and 2 consist of 10 amino acid repeats important for functional conformation of peptide chains and attachment of C. albicans cells to the mammalian epithelia. Region 3 consists of 34 amino acid that promote the cross-linking with other proteins on C. albicans surface. The HWP1-2 homozygous (L757) and heterozygous (L296) strains have significantly lower levels of HWP1 expression during hyphal growth and biofilm formation compared to the strain SC5314 (HWP1-1). L757 has reduced hyphal growth (40.4%) and impaired biofilm formation (90.8%), suggesting that the HWP1-2p is less efficient to maintain cell-to-cell and cell-to-surface adhesion during biofilm formation. Our results clearly show that any study of fungal pathogenicity factors have to be solidly based on molecular systematics, which in turn, has to be grounded on the explicitly quantitative methods of Statistics, Dynamic Systems Theory and computational algorithms.
Palavra-chave Evolução molecular
Fatores de virulência
RNA ribossômico
Fungos
Candida albicans
Idioma Português
Financiador Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Howard Hughes Medical Institute (HHMI)
World Health Organization (WHO)
Data de publicação 2008
Publicado em PADOVAN, Ana Carolina Barbosa. Estudo da evolução molecular de sequências de rDNA 18S aplicado à investigação de fatores de patogenicidade do filo Ascomycota. 2008. 231 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2008.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 231 f.
Direito de acesso Acesso aberto Open Access
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23716

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Nome: Publico-23716.pdf
Tamanho: 20.79MB
Formato: PDF
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