Caracterização genética e bioquímica da BKC-1, uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, isolada de amostras clínicas de Klebsiella pneumoniae

Caracterização genética e bioquímica da BKC-1, uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, isolada de amostras clínicas de Klebsiella pneumoniae

Autor Nicoletti, Adriana Giannini Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Gales, Ana Cristina Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Infectologia – São Paulo
Resumo Em bacilos Gram negativos, a produção de β-lactamases é o fator contribuinte mais importante para a aquisição de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos. As carbapenemases, β-lactamases com eficiência catalítica contra os carbapenens, representam a família mais versátil destas enzimas, possuindo um amplo espectro de atividade, que compreende quase todos os antimicrobianos β-lactâmicos. O objetivo deste estudo foi caracterizar geneticamente e bioquimicamente uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, identificada em amostras clínicas de Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenens, isoladas de dois hospitais da cidade de São Paulo. Material e métodos: O teste de sensibilidade foi realizado pela técnica de microdiluição, de acordo com as recomendações do CLSI. O teste de hidrólise foi realizado para verificar se as amostras eram capazes de degradar o imipenem por meio da produção de enzimas. A reação da cadeia em polimerase foi utilizada para a detecção dos genes codificadores de β-lactamases, seguida pela reação de sequenciamento dos respectivos amplicons. A corrida eletroforética em géis de poliacrilamida com intervalos conhecidos de pH foi realizada para determinar o pI das β-lactamases presentes. A relação genética entre as amostras foi determinada pela técnica de PFGE, e o perfil plasmidial foi determinado por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8% após a extração dos plasmídeos por duas metodologias diferentes. A transformação foi utilizada para determinar se o gene responsável pela resistência aos carbapenens estava localizado no plasmídeo, seguido pelo sequenciamento em larga escala do plasmídeo carreador do gene de resistência aos carbapenens. Após a identificação do gene, experimentos de cinética enzimática foram realizados para determinar os parâmetros bioquímicos da nova enzima. A determinação da frequência do gene blaBKC foi realizada por PCR para uma coleção de 472 amostras de Klebsiella spp. Resultados: O teste de sensibilidade confirmou a resistência a todos os antimicrobianos testados, incluindo os carbapenens, as quinolonas, e os aminoglicosídeos canamicina e amicacina. A hidrólise dos carbapenens foi detectada em todos os isolados, sendo inibida somente pelo ácido clavulânico. A PCR revelou a presença dos genes blaCTX-M-2 e blaSHV-like. Entretanto, nenhum gene codificador de carbapenemases foi detectado. As três amostras pertenciam ao mesmo clone e apresentaram o mesmo perfil plasmidial, com a presença de quatro plasmídeos (2, 8, 10 e 140 Kb). Somente o plasmídeo de 10 Kb foi recuperado da cepa transformante, sendo totalmente sequenciado. Além dos genes de mobilização e replicação, o plasmídeo também apresentou o gene aphA, responsável pela resistência aos aminoglicosídeos, e uma ORF que codificava uma proteína de 313 aminoácidos correspondente a uma β-lactamase, que foi nomeada de blaBKC. Esta enzima possui maior similaridade com uma β-lactamase presente no plasmídeo do Sinorhizobium meliloti AK83 (63%). O transformante mostrou um aumento de 10 vezes na CIM do ertapenem. Dentre as 472 amostras pesquisadas, somente uma carreava o gene blaBKC, correspondendo a uma frequência de 0,2%, Conclusões: Apesar da disseminação de K. pneumoniae produtora de KPC no Brasil, nós identificamos uma nova carbapenemase pertencente a classe A, demonstrando a diversidade e rápida evolução das β-lactamases em isolados clínicos de K. pneumoniae..
Palavra-chave Carbapenêmicos
Klebsiella pneumoniae
Enterobacteriaceae
beta-Lactamases
Hidrólise
Idioma Português
Financiador Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Data de publicação 2014
Publicado em NICOLETTI, Adriana Giannini. Caracterização Genética e Bioquímica da BKC-1, uma Nova Carbapenemase da Classe A de Ambler, Isoladas de Amostras Clínicas de Klebsiella pneumoniae. 2014. 146 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2014.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 145 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23264

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Nome: Tese-14460.pdf
Tamanho: 2.055MB
Formato: PDF
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