Importância do domínio extracelular e transmembranal para ligação e ativação do receptor B1 de cininas

Importância do domínio extracelular e transmembranal para ligação e ativação do receptor B1 de cininas

Título alternativo Role of the extracellular and transmembranal domains to binding and activation of kinin B1 receptor: correlation with the structureactivity of the angiotensin II type I receptor
Autor Rodrigues, Eliete da Silva Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Shimuta, Suma Imura Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo Objetivo: Avaliar a importancia do dominio extracelular e transmembranal na ligacao e ativacao do B1R a luz dos estudos envolvendo a estruturauatividade do receptor AT1R da AngII, identificando os residuos importantes na interacao entre a DBK (Arg - Pro - Pro - Gly - Phe - Ser u Pro u Phe) e o B1R. Metodos: Os registros de contracao isometrica de fundus de camundongos C57Bl/6 em resposta a DBK e seus analogos foram realizados para determinar a atividade biologica dos peptideos, previamente sintetizados, com substituicao de cada residuo isoladamente por Ala, a Arg1 por Lys e Gly4 por Leu; a linhagem celular expressando o B1R selvagem foi gerada por meio de transfeccao estavel do vetor contendo o clone do B1R em celulas CHO; os mutantes do B1R com substituicao da Cys25 por Ser (C25S), com a substituicao de Asn130 por Ala (N130A) e com a substituicao de Asp301 por Ala (D301A) foram gerados seguindo o protocolo do kit de mutacao sitio-dirigida e apos essa etapa foram estavelmente transfectadas nas celulas CHO; a PCR em tempo real foi utilizada para determinar os niveis de expressao genica relativa dos receptores transfectadas; o perfil de ligacao dos peptideos analogos da DBK ao B1R selvagem e mutantes foram determinados por meio de testes de ligacao por competicao homologa e a expressao funcional atraves de ensaios de producao de IP3 e concentracao de calcio intracelular em resposta aos analogos da DBK. Medidas de producao basal de IP3 foram realizadas para avaliacao da atividade constitutiva dos mutantes. Resultados: A afinidade de ligacao da Ala6- DBK e Lys1-DBK mantiveram os mesmos niveis observados para a DBK, porem foi sensivelmente reduzida para Ala7-DBK e Lys0-DBK. Os analogos Ala2-, Ala3-, Ala4-, Ala5- e Ala8-DBK demonstraram uma afinidade reduzida em relacao ao peptideo selvagem, enquanto os analogos Leu4-DBK e Ala1-DBK demonstraram uma drastica reducao na afinidade. A expressao dos mutantes, assim como do receptor selvagem em celulas eucarioticas apresentaram niveis comparaveis entre si. A mutacao D301A diminuiu drasticamente a afinidade da DBK e seus analogos em relacao ao receptor selvagem, enquanto o mutante C25S apresentou uma queda na afinidade de ligacao para a DBK e seus analogos um pouco mais elevada que no mutante D301A. O perfil de queda do efeito dos analogos da DBK obtido pelo mutante C25S foi semelhante a queda observada pelo mutante D301A. A mutacao gerada pela substituicao da Asn130 por Ala tambem afetou a resposta induzida pelos analogos da DBK, promovendo uma melhora na afinidade e na ativacao do receptor mutado, ao contrario do que foi observado no selvagem. Tanto o mutante C25S quanto o N130A apresentaram uma elevada producao basal de IP3 em relacao ao selvagem. Conclusoes: Os residuos Arg1, Pro2, Pro3, Gly4 e Phe8 parecem desempenhar um papel importante na ligacao entre a DBK e o B1R, ja os residuos localizados nas posicao 5, 6 e 7 da DBK aparentemente atuam como residuos espacadores da molecula. Mutacoes do sitio extracelular do B1R, como no mutante D301A e C25S causaram uma reducao na afinidade de ligacao da DBK e analogos. A carga negativa presente no topo da helice VII no residuo Asp301 parece interagir com a Arg1 da DBK. O mutante C25S possui maior atividade basal em relacao ao receptor selvagem, indicando que o receptor assumiu uma conformacao semelhante a do receptor ativado observado no caso do AT1R com a mutacao equivalente. Da mesma forma, a troca da Asn130 por Ala, na helice III, induziu uma elevada atividade constitutiva do B1R, alem da falta de reconhecimento dos sitios importantes para interacao entre a DBK e o B1R selvagem. O modelo 3D do B1R desenvolvido a partir da estrutura do receptor CXCR4 da Quimiocina representa um importante modo de representacao para estudos de mutagenese e para melhorar a compreensao sobre o mecanismo funcional do receptor
Palavra-chave Animais
Mutagênese
Receptor B1 da bradicinina
Camundongos endogâmicos C57BL
Peptídeos
Estômago
Animais
Idioma Português
Data de publicação 2013
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2013. 133 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 133 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23248

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