Importância do resíduo N-terminal da bradicinina e dos sítios extracelulares do receptor B2 de cininas na ligação e ativação: estudo com mutantes e análogos da bradicinina

Importância do resíduo N-terminal da bradicinina e dos sítios extracelulares do receptor B2 de cininas na ligação e ativação: estudo com mutantes e análogos da bradicinina

Título alternativo Importance of N-terminal residue of bradykinin and extracellular sites of kinin B2 receptor on binding and activation: study with mutants and analogues
Autor Silva, Rafael Filippelli da Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Shimuta, Suma Imura Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Ciências biológicas (biologia molecular) – São Paulo
Resumo Objetivos: Reavaliar o papel da arginina N-terminal da bradicinina; determinar a potencia, eficacia e parametros de ligacao dos analogos Ala1BK, Gly1BK, Glu1BK e Lys1BK; obter os mutantes Glu196Ala e Asp268Ala; expressar estavelmente o receptor B2 de cininas e os mutantes B2-E196A e B2-D268A em celulas ovarianas de hamster chines; estudar as consequencias dessas mutacoes sobre a expressao funcional e sobre a ligacao com a BK, assim como com os analogos. Metodos: Os valores de potencia e a eficacia foram determinados atraves de registros de contracao isometrica em fundus de estomago de camundongos C57/Bl6, e por meio de ensaios de mobilizacao de Ca2+ intracelular. Os parametros de ligacao foram determinados atraves de ensaios de obindingo por competicao, por metodo fluorimetrico, usando o ligante BK marcado com Europium. Os mutantes foram gerados no vetor de expressao pcDNA3.1 V5-His, contendo o inserto do receptor B2, segundo instrucoes do protocolo QuickChange® II Site-Directed Mutagenesis e transfectados em celulas CHO seguindo o protocolo Lipofectamine 2000. Reacao em cadeia da polimerase em tempo real foi utilizada para determinacao dos niveis de expressao genica relativa dos receptores transfectados. Resultados: Em relacao ao receptor selvagem, o analogo Ala1BK foi o que sofreu a reducao mais drastica de potencia e afinidade de ligacao; a Gly1BK teve sua potencia e afinidade de ligacao pouco reduzida, porem sua eficacia foi marcadamente inferior a da BK; a Glu1BK nao apresentou valores de resposta detectaveis; a Lys1BK teve sua eficacia levemente reduzida, porem os outros parametros determinados foram severamente reduzidos. A mutacao E196A diminuiu em 2,1x a afinidade da BK; neste mutante, os analogos tiveram eficacia similar entre si, e a reducao nos valores de potencia e afinidade de ligacao foram atenuados quando comparados ao receptor selvagem. No mutante B2-D268A, os resultados obtidos com a BK quanto a eficacia, potencia e afinidade de ligacao foram 1,3x, 13,9x, e 14,8x reduzidos, respectivamente, em comparacao ao receptor nao mutado; nenhum dos analogos apresentou valores detectaveis de atividade neste mutante. Conclusoes: Os resultados nos permitem concluir que: o guanido grupo da Arg1 e essencial para a interacao com o receptor; a presenca de Ala1, Gly1 e Lys1 em substituicao a Arg1 induz reducao na potencia, eficacia e afinidade de ligacao; a Glu na posicao 1 da BK leva a perda na capacidade de ligacao e da atividade do peptideo; os analogos ativam especificamente o receptor B2 de cininas; os receptores foram expressos estavelmente e com niveis similares de expressao; a expressao do receptor B2 transfectado reproduz satisfatoriamente a expressao endogena do fundus de estomago; as mutacoes nao afetaram a atividade basal do receptor; a reducao dos valores farmacologicos e de ligacao dos analogos foi atenuada no mutante B2-E196A; a mutacao Asp268Ala afeta a eficacia e a potencia da BK, e impediu o obindingo dos analogos
Palavra-chave Receptor B2 da Bradicinina
Bradicinina
Proteínas Mutantes
Cálcio
Idioma Português
Financiador Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Data de publicação 2013
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2013. 105 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 105 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Dissertação de mestrado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23227

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