O silenciamento do proteoglicano sindecam-4 e a mutação na proteína Ras levam à tranformação de células endoteliais

O silenciamento do proteoglicano sindecam-4 e a mutação na proteína Ras levam à tranformação de células endoteliais

Título alternativo The proteoglycan syndecan-4 silencing and the Ras protein mutation alter endothelial cells
Autor Cavalheiro, Renan Pelluzzi Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Nader, Helena Bonciani Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Ciências Biológicas (Biologia Molecular) – São Paulo
Resumo Os sindecans constituem uma familia de quatro membros de proteoglicanos transmembranicos, que apresentam em geral cadeias de glicosaminoglicanos de heparam sulfato covalentemente ligadas ao esqueleto proteico. O sindecam-4 (Syn4) desempenha importante papel no comportamento celular, devido a sua interacao pelas cadeias de heparam sulfato (HS), com uma variedade de moleculas da regiao extracelular. O dominio citoplasmatico do sindecam-4 interage com proteinas citoplasmaticas, ativando proteinas de vias de sinalizacao, como por exemplo, a via Ras/Raf/MAP quinases. A transducao de sinal de Ras/Raf/MAP quinases tem papel chave na regulacao de eventos de crescimento celular, diferenciacao celular e sobrevivencia celular, e as mutacoes pontuais em Ras podem ocorrer, estando associada com o desenvolvimento de canceres humanos, inclusive na superexpressao do proteoglicano sindecam-4. Para elucidar o papel do sindecam-4 e da proteina Ras em eventos celulares de celulas endoteliais, realizamos o silenciamento para a porcao proteica deste proteoglicano pela tecnica de short hairpin RNA e a mutacao da proteina Ras pela transfeccao com oncogene EJ-ras. Assim, celulas endoteliais silenciadas para o sindecam-4 (shRNA-Syn4-EC) e celulas transfectadas com oncogene EJ-ras (EJ-ras-EC), foram analisadas em estudo comparativo com celulas endoteliais selvagens (EC). As celulas shRNA-Syn4-EC apresentam diminuicao na sintese de HS e CS (condroitim sulfato); ja EJ-ras-EC apresentam aumento da sintese de HS. Ambas as celulas mostram alteracoes na morfologia celular e desorganizacao do citoesqueleto, e nitida perda das formacoes de adesoes focais. A deficiente adesao celular aos substratos de fibronectina e laminina foi observada para as celulas shRNA-Syn4-EC, contrastando com EJ-ras-EC, que independem da concentracao desses substratos para adesao. A diminuicao da expressao de fibronectina por essas celulas e evidente, e a distribuicao e expressao da integrina 1 esta alterada apenas para as celulas shRNASyn4- EC. As celulas shRNA-Syn4-EC mostram diminuicao da expressao da proteina Ras, diferentemente de EJ-ras-EC, que nao so super expressam Ras, mas tambem secretam essa proteina via microvesiculas para o ambiente extracelular. O silenciamento de sindecam-4 e a mutacao em Ras levam a alteracao do ciclo celular das celulas endoteliais. As celulas que super expressam Ras apresentam nitido aumento da proliferacao celular quando comparadas com as celulas EC selvagens. Mudancas na ativacao/fosforilacao de proteinas intracelulares como Src, MEK e ERK, tambem foram observadas em ambas as celulas. O processo de angiogenese realizado pelas celulas endoteliais em membrana basal reconstituida e afetado pelo silenciamento de sindecam-4; ja a superexpressao de Ras nao afeta esse evento. Por outro lado, ambas as celulas aumentam o conteudo intracelular e a secrecao do fator de crescimento VEGF, diferentemente do fator TGF-β que esta presente apenas nos extratos celulares, e em baixa quantidade. Os resultados tambem mostram que as celulas shRNA-Syn4-EC e EJ-ras-EC apresentam crescimento independente de ancoragem, pelo ensaio de formacao de colonia em agar semi solido (osofto agar) e formam tumores quando injetadas no tecido subcutaneo de camundongos BALB / c-SCID e NUDE; alem disso, a mutacao em Ras torna essas celulas capazes de induzir metastase in vivo. Cabe ainda dizer, que o silenciamento de sindecam-4 e a mutacao de Ras em celulas endoteliais, nao induzem o processo de diferenciacao e transicao dessas celulas para o tipo mesenquimal. Em conclusao, as celulas endoteliais com mutacoes na proteina Ras mostram alteracoes fenotipicas e fisiologicas, incluindo superexpressao do sindecam-4, como observado para outros tipos celulares. Nossos resultados demonstram pela primeira vez na literatura que alteracoes na expressao do sindecam-4 promovem mudancas fenotipicas e na fisiologia normal das celulas endoteliais. O simples silenciamento do proteoglicanos de heparam sulfato levou a alteracoes na arquitetura da celula, no ciclo celular, na capacidade angiogenica, entre outras mudancas, incluindo a capacidade de induzir tumores in vivo. Podemos concluir que tanto o proteoglicano sindecam-4, como a proteina Ras, sao moleculas essenciais na homeostasia celular, e que, o silenciamento de sincecam-4 ou a mutacao em Ras, alteram uma serie de eventos celulares que afetam o correto comportamento celular de celulas endoteliais
Palavra-chave Glicosaminoglicanas
Proteoglicanas
Sindecana-4
Proteínas Oncogênicas
Células Endoteliais
Financiador Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Data de publicação 2014
Publicado em CAVALHEIRO, Renan Pelluzzi. O silenciamento do proteoglicano sindecam-4 e a mutação na proteína Ras levam à tranformação de células endoteliais. 2014. 153 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2014.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 153 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23202

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Nome: Tese-14245.pdf
Tamanho: 10.15MB
Formato: PDF
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