Desenvolvimento de substratos seletivos para catepsina S utilizando peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência

Desenvolvimento de substratos seletivos para catepsina S utilizando peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência

Título alternativo Development of substrates selective for cathepsin S peptides using FRET fluorescence
Autor Oliveira, Marcela de Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Carmona, Adriana Karaoglanovic Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo A catepsina S e uma cisteino-peptidase lisossomal da superfamilia da papaina que esta implicada em diversos processos fisiologicos e patologicos. A enzima e altamente expressa em celulas apresentadoras de antigenos e possui funcao importante no processamento da cadeia invariante do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe II. Em processos patologicos, a catepsina S esta associada a doenca de Alzheimer, aterosclerose e obesidade. Devido a ampla especificidade apresentada pelas catepsinas lisossomais, a deteccao especifica de catepsina S e dificultada em tecido onde outras catepsinas estao presentes. Na presente tese descrevemos o desenvolvimento de um substrato fluorogenico seletivo capaz de distinguir a catepsina S das outras catepsinas tendo como base dois substratos naturais da catepsina S, a cadeia ! da insulina e a cadeia invariante do MHC de classe II (CLIP). A influencia da forca ionica na atividade catalitica e a estabilidade da enzima em pH neutro tambem foram analisadas. Assim, desenvolvemos um substrato seletivo para catepsina S e estabelecemos condicoes de ensaio para diferenciar esta enzima das catepsinas L, B, V e K. O peptideo Abz-LEQ-EDDnp (Abz = acido ortoaminobenzoico; EDDnp = N-[2,4-dinitrofenil]etilenodiamina) e hidrolisado pela catepsina S em tampao fosfato de sodio 50mM, pH 7,4, contendo 1M de NaCl com valor de kcat/Km de 3.585 mM-1s-1, sendo nestas condicoes de ensaio, Abz-LEQ-EDDnp resistente a hidrolise pelas catepsinas L, V, K e B. Este substrato ainda se mostrou eficiente na medicao continua da atividade enzimatica em homogenatos de tecidos de rato. Estudos recentes mostraram que as catepsinas L, S e K sao expressas no tecido adiposo e foram apontadas como importantes moleculas em adipogenese e aterosclerose. Mais especificamente, foi descrito que a catepsina S esta envolvida na obesidade e e forte candidata a potenciar o desenvolvimento de lesoes ateroscleroticas em humanos. O tecido adiposo tem importantes propriedades metabolicas e pode produzir adipocinas, que sao moleculas bioativas envolvida em muitos processos fisiologicos e patologicos. Dentre elas destaca-se a leptina que desempenha um papel importante nao so na regulacao do apetite e balanco energetico, mas tambem na aterosclerose, controle da pressao arterial e osteogenese. A falta de estudos sobre a degradacao da leptina nos levou a investigar in vitro a acao da das catepsinas humanas recombinantes B, K, L e S sobre a leptina. Demonstramos por eletroforese em gel de poliacrilamida e espectroscopia de massa que a catepsina S apresenta alta atividade hidrolitica sobre a leptina em pH 6,0 e 7,4. Os fragmentos gerados pela hidrolise nao apresentaram acao angiogenica em celulas endoteliais in vitro. Alem disso, os fragmentos de leptina gerados nao foram capazes de inibir a inGestão alimentar em ratos Wistar apos administracao intracerebroventricular, sugerindo que a catepsina S pode ser um regulador da atividade da leptina
Palavra-chave Animais
Catepsinas
Leptina
Ratos Wistar
Idioma Português
Data de publicação 2011
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2011. 74 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 74 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/22661

Exibir registro completo




Arquivo

Arquivo Tamanho Formato Visualização

Não existem arquivos associados a este item.

Este item está nas seguintes coleções

Buscar


Navegar

Minha conta