Papel do colesterol e fitoesterol no processo de solubilizacao de membranas modelo por detergente

Papel do colesterol e fitoesterol no processo de solubilizacao de membranas modelo por detergente

Autor Franca, Ana David Cruz Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo Detergentes sao moleculas anfifilicas largamente utilizadas como agentes solubilizadores de membranas biologicas. Entretanto, varios tipos de membrana apresentam, quando tratadas com detergentes, fragmentos insoluveis, chamados de DRMs (membranas resistentes a detergentes), ricos em lipidios saturados, colesterol e certas proteinas. Esses DRMs guardam semelhanca de composicao com os rafts de membrana, que sao microdominios mais organizados. Portanto, existe uma tendencia de associar DRMs a rafts e a membranas na fase liquido-ordenada (compostas de lipidios saturados e colesterol). O mecanismo de solubilizacao de membranas biologicas tem sido muito estudado com membranas modelo (bicamadas lipidicas formando vesiculas), e e em geral descrito em tres estagios a medida que a razao molar Rb = detergente ligado/lipidio aumenta: i) inicialmente, as moleculas de detergente sao incorporadas nas bicamadas sem causar seu rompimento; ii) quando um limite de saturacao e atingido (Rb,sat) o processo de solubilizacao tem inicio e bicamadas ricas em detergentes coexistem com micelas mistas; iii) ao final (acima de Rb,sol), nao restam mais bicamadas e todos os lipidios sao incorporados em estruturas micelares. Neste trabalho, o processo de solubilizacao de membranas modelo foi estudado com bicamadas lipidicas de diferentes composicoes a temperatura ambiente e em diferentes fases, formando vesiculas unilamelares grandes (LUVs) e gigantes (GUVs). O detergente empregado foi o Triton X-100 (TX-100), amplamente utilizado como agente solubilizador de membranas biologicas. As composicoes lipidicas e fases estudadas foram: POPC (palmitoil oleoil fosfatidilcolina, um lipidio insaturado) na fase fluida; SM (esfingomielina, um lipidio saturado) na fase gel; POPC/esterol 7:3 mol:mol na fase fluida; e SM/esterol 7:3 mol:mol na fase liquido-ordenada. Dois esterois distintos foram utilizados: o colesterol, o esterol mais abundante em membranas de animais, e o estigmasterol, um fitoesterol encontrado em membranas de celulas vegetais. Tres tecnicas foram empregadas. A microscopia optica de GUVs foi utilizada para observar o processo de solubilizacao de GUVs em presenca de TX-100. O espalhamento de luz a 90º de uma dispersao de LUVs a medida que aliquotas de uma suspensao de TX-100 eram adicionadas permitiu o monitoramento do processo de solubilizacao, que leva a uma reducao drastica no tamanho das estruturas formadas. A calorimetria de titulacao isotermica (ITC), que mede o calor de reacao de LUVs a medida que sao tituladas com TX-100, foi empregada para obter aspectos termodinamicos do processo de solubilizacao de LUVs de diferentes composicoes. Os resultados obtidos mostraram que o processo de solubilizacao depende fortemente da composicao lipidica empregada. Vesiculas na fase liquido-ordenada (SM/esterol) mostraram-se praticamente insoluveis, enquanto que vesiculas nas fases fluida (POPC) e gel (SM) foram completamente solubilizadas. Vesiculas de POPC/esterol foram apenas parcialmente solubilizadas. Durante o estagio I, de incorporacao de TX-100 nas vesiculas, foi observado por microscopia optica um aumento de area superficial de GUVs de POPC, um enrugamento na superficie de GUVs de SM e um aumento de curvatura espontanea de GUVs de POPC/esterol. Estas mudancas morfologicas indicam que a taxa de flip-flop do TX-100 e modulada pela composicao e fase da membrana. A taxa de flip-flop em membranas de POPC e extremamente rapida, nao parece se alterar substancialmente em GUVs de SM, mas torna-se bem mais lenta com a adicao de esterol. Medidas de espalhamento de luz e ITC mostraram que o limite de saturacao de bicamadas de POPC foi atingido em Rb,sat = 0,4. Este valor diminuiu um pouco em bicamadas de SM, mas caiu a metade em membranas de POPC/esterol, o que poderia ser explicado pelas diferentes taxas de flip-flop. O limite de solubilizacao de bicamadas de POPC ocorreu em Rb,sol ~ 2,3. A solubilizacao completa de bicamadas de SM, na fase gel, foi atingida em razoes bem menores: ~ 0,6, mostrando que bicamadas na fase gel sao mais soluveis que na fase fluida. Medidas de ITC indicaram que o processo de solubilizacao de vesiculas de SM e acompanhado da fluidificacao das moleculas de SM. A solubilizacao de POPC/esterol nao foi completa, e por espalhamento de luz atingiu um valor minimo em Rb,sol = 0,8 (POPC/colesterol) e 1,4 (POPC/estigmasterol). Dos resultados obtidos pode-se concluir que a resistencia a solubilizacao so ocorre na fase liquido-ordenada (SM/esterol). Entretanto, a composicao POPC/esterol mostrou-se parcialmente insoluvel, devido provavelmente a uma baixa miscibilidade TX-100/colesterol
Palavra-chave Lipídeos
Colesterol
Estigmasterol
Detergentes/química
Solubilidade
Lipossomas Unilamelares
Idioma Português
Data de publicação 2012
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2012. 81 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 81 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/22459

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