Terapia de mucopolissacaridose tipo I com as celulas-tronco mesenquimais modificadas com o gene IDUA carreado pelo sistema Sleeping Beauty

Terapia de mucopolissacaridose tipo I com as celulas-tronco mesenquimais modificadas com o gene IDUA carreado pelo sistema Sleeping Beauty

Autor Matsumoto, Priscila Keiko Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo MPSI e uma doenca de acumulo lisossomal sistemico de carater autossomico recessivo, que leva a uma serie de alteracoes metabolicas e compromete o desenvolvimento dos portadores, requerendo fornecimento constante da IDUA para aliviar a manifestacao da doenca. Varios estudos de terapia genica em modelos animais foram realizados utilizando, principalmente, vetores virais, no entanto, nao ha um procedimento terapeutico validado ate o momento. Para que a terapia genica se torne realidade para o tratamento de MPSI, ha tres condicoes fundamentais a serem incorporadas no tratamento: expressao prolongada de IDUA, reducao de imunogenicidade contra IDUA e aumento de biosseguranca com vetores e celulas modificadas geneticamente. Como objetivo deste trabalho, buscamos responder a seguinte questao: As celulas-tronco mesenquimais (CTM) modificadas com o gene IDUA atraves do Sistema Sleeping Beauty podem fornecer a enzima suficiente para beneficio dos camundongos KO-IDUA longamente sem alertar o sistema imune? Esta pergunta se baseia na propriedade imunossupressora das CTM associado ao vetor nao viral e integrativo Sleeping Beauty, que poderao satisfazer as tres condicoes citadas. Inicialmente, varios vetores com diferentes promotores foram construidos e testados em CTM utilizando nucleofeccao, eletroporacao e Fugene para transfeccao. Alem disso, as transposases SB11 e SB100X foram avaliadas com objetivo de obter maior nivel de transfeccao, transposicao, expressao e duracao genica. Em todas as situacoes a SB100X levou a uma maior expressao de GFP e IDUA por mais tempo. A nucleofeccao nas MSC-KO permitiu uma expressao genica de 80%, mais eficiente em comparacao a eletroporacao e ao Fugene. O plasmidio pT2-CAGGS-IDUA, que controla a expressao da IDUA pelo promotor CAGGS, com pCMV-SB100X teve atividade de IDUA nas MSC-KO 100 vezes maior que o normal, e permaneceu elevado por 30 dias, enquanto que o vetor com o promotor CMV sofreu queda na expressao, indicando silenciamento. Para facilitar a injecao de CTM modificadas com IDUA, duas vias foram avaliadas: intravenosa e intraperitoneal. A injecao intravenosa levou alta mortalidade de animais no inicio do experimento, provavelmente, por embolia. Por outro lado, a injecao via intraperitoneal nao levou a nenhuma morte e o procedimento foi bem mais facil e reproduzivel. Atraves do uso de CTM marcadas com radioisotopo 111I, localizamos a presenca de CTM em quase todos os orgaos, principalmente os localizados proximo ao peritonio, como o baco. Para terapia, os camundongos KO-IDUA adultos receberam CTM expressando IDUA via intraperitoneal com 3 injecoes. A atividade de IDUA foi detectada no plasma de 5 animais no primeiro dia apos a segunda injecao, com queda ao longo dos dias. Foi detectado anticorpos anti-IDUA nestes animais, o que justifica a queda da expressao genica. Mesmo com a expressao da IDUA nao sustentada, os animais tratados tiveram reducao de dermatan sulfato no baco e heparan sulfato no figado, e consequentemente uma melhora organizacional do figado e reducao na area dos hepatocitos. Estes resultados indicam que a administracao de CTM via intraperitoneal e util para celulas grandes como as CTM. Sua propriedade imunossupressora nao foi eficiente para reduzir imunogenicidade contra IDUA expressa permanentemente via Sleeping Beauty, mas a atividade de IDUA inicial foi suficiente para reduzir GAG no baco e no figado
Palavra-chave Mucopolissacaridoses
Terapia Genética
Células Mesenquimais Estromais
Idioma Português
Data de publicação 2011
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2011. 97 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 97 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/22346

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