Desenvolvimento de PCR em tempo real para detecção rápida de Escherichia coli diarreiogênica

Desenvolvimento de PCR em tempo real para detecção rápida de Escherichia coli diarreiogênica

Título alternativo Development of real-time PCR for rapid detection of diarrheagenic Escherichia coli
Autor Souza, Tamara Barros de Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Scaletsky, Isabel Cristina Affonso Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo Introdução: no Brasil, as Escherichia coli ainda estao entre as causas mais importantes de diarreia aguda particularmente em criancas. Com os conhecimentos biologicos, clinicos e epidemiologicos mais aprofundados, foram estabelecidos seis patotipos diferentes de E. coli diarreiogenica (DEC): E. coli enteropatogenica (EPEC), E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora de toxinas de Shiga (STEC) ou E. coli enterohemorragica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC). A identificacao dos diferentes patotipos representa um desafio, pois o uso de apenas testes bioquimicos e provas sorologicas nao sao suficientes na deteccao de alguns patotipos. Objetivo: avaliar o desempenho da tecnica da PCR em tempo real para o diagnostico de infeccoes por DEC visando a sua utilizacao na rotina laboratorial. Resultados: inicialmente, foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real para a deteccao simultanea dos seis patotipos de DEC, e subdivisao de EPEC em tipica e atipica, utilizando o sistema de deteccao SYBR®Green. Este ensaio utiliza nove conjuntos de primers especificos para as sequencias geneticas: eae e pEAF de EPEC, aatA de EAEC, afaBC de DAEC, elt e est de ETEC, ipaH de EIEC e stx1 e stx2 de STEC em uma unica reacao. Posteriormente um segundo ensaio foi desenvolvido para deteccao dos patotipos mais frequentes em nosso meio, EPEC, EAEC e DAEC. Neste ensaio foi escolhido o sistema de deteccao TaqMan® e quatro conjuntos de primers/sondas para detectar a presenca das sequencias geneticas eae e pEAF de EPEC, aatA de EAEC e afaBC de DAEC. Em seguida, a especificidade dos ensaios foi avaliada em amostras comprovadas de DEC, amostras de E. coli nao patogenicas e amostras de outras enterobacterias. Todas as amostras de DEC e de Shigella spp. emitiram sinal de fluorescencia forte e positivo. A sensibilidade foi determinada com as amostras prototipo, e o limite de deteccao foi de aproximadamente 102UFC/mL; em amostras de fezes nao diarreicas inoculadas com diferentes concentracoes de amostras prototipo de DEC, os limites de deteccao variaram de 2,5x107 a 4,5x105UFC/ml por grama de fezes nos ensaios de PCR TaqMan® e PCR SYBR®Green. A aplicacao das PCRs em tempo real foi realizada em amostras de E. coli isoladas das fezes de 97 criancas Quilombolas com diarreia e 285 criancas controle do Espirito Santo, e os resultados comparados com os de PCR convencional e hibridizacao de colonias. Houve total concordancia entre os resultados obtidos com ambos os ensaios, entretanto a PCR SYBR®Green detectou 52 amostras a mais que a PCR convencional e a PCR TaqMan® detectou 96 a mais que a hibridizacao de colonias mas nao identificou 7 amostras. O calculo de coeficiente de Kappa mostrou forte correlacao (0,81) entre a PCR SYBR®Green e a PCR convencional e boa correlacao (0,61) entre a PCR TaqMan® e o teste de hibridizacao de colonias. Conclusao: nossos ensaios de PCR em tempo real oferecem possibilidade de uma rapida e sensivel identificacao simultanea dos diferentes patotipos de DEC, podendo ser utilizados em laboratorios clinicos e de pesquisa
Palavra-chave Criança
Escherichia coli
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Child
Escherichia coli
Real-Time Polymerase Chain Reaction
Idioma Português
Data de publicação 2012
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2012. 106 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 106 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/22328

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