Papel do diferentes dominios de metaloproteases de venenos botropicos nas alteracoes da interacao leucocito-endotelio da microcirculacao do musculo cremaster de camundongos

Papel do diferentes dominios de metaloproteases de venenos botropicos nas alteracoes da interacao leucocito-endotelio da microcirculacao do musculo cremaster de camundongos

Título alternativo Role of different domains of Bothrops metalloproteases on the alterations in leukocyte-endothelium interaction of the microcirculation of murine cremaster: action of proteases inhibitors
Autor Zychar, Bianca Cestari Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo Nos envenenamentos botropicos sao observadas intensas reacoes locais, resultado da hemorragia e resposta inflamatoria no local da picada. Dos componentes presentes nestes venenos as metaloproteases sao consideradas uma das principais responsaveis por estas atividades. As SVMP (Snake venom metalloproteinase) sao divididas por subclasses de acordo com a organizacao dos seus dominios (PI a PIII). Sabe-se que determinadas acoes biologicas destas toxinas sao atribuidas a dominios especificos. Usando tres SVMPs, avaliamos a participacao dos diferentes dominios nas alteracoes das interacoes leucocitoendotelio (ILE) apos a exposicao a essas toxinas na microcirculacao do cremaster de camundongos, sendo tambem avaliada a acao de inibidores de proteases nessas alteracoes. Para tanto utilizamos a jararagina (Jar), uma SMVP classificada como PIII, com uma forte atividade hemorragica, constituida pelo dominio catalitico, ECD-desintegrina e rico-cisteina; Jar-C, uma forma degradada de Jar desprovida do dominio catalitico, sem atividade hemorragica e BnP1, uma SMVP hemorragica classificada como PI, que possui apenas o dominio catalitico. Toxinas (0.5μg) ou PBS (100 μL) foram injetadas na bolsa escrotal de camundongos. Leucocitos aderidos e migrados foram contados em venulas pos-capilares por microscopia intravital 2 ou 24 h apos as injecoes. Observou-se aumento de leucocitos aderidos e migrados, apos 2 e 24 h da injecao das toxinas, respectivamente. A ILE ocorre pela expressao de moleculas de adesao da superficie de leucocitos e no endotelio vascular, assim verificamos a expressao proteica e genica das moleculas expressas no endotelio vascular: ICAM-1 e PECAM-1 envolvidas na adesao e migracao celular, respectivamente. E das integrinas LFA-1α(CD11a) e Mac-1α(CD11b) expressas em leucocitos. Houve aumento de ICAM-1, CD11a e CD11b nos tempos iniciais, e aumento na expressao de PECAM-1 em tempos mais tardios, nos grupos injetados com as toxinas. Inibindo-se a atividade catalitica da Jar e da BnP1 pelo tratamento com 1,10-fenantrolina (oPhe) houve uma completa inibicao das alteracoes, quando comparada aos efeitos induzidos pelas toxinas sem inibicao. Uma vez que a Jar, tambem possui os dominios ECD-disintegrina e rico-cisteina, e os resultados com Jar-C mostram que esses dominios tambem sao capazes de induzir alteracoes na ILE, estudamos se o tratamento com oPhe promoveu alguma alteracao conformacional na Jar por dicroismo circular. A estrutura da Jar foi alterada, indicando que este quelante promove a perda de uma parte da estrutura da Jar, e que esta associada, a diminuicao da quantidade de estruturas em alfa-helice. Ainda para identificarmos se as alteracoes ocorridas na Jar pelo tratamento com oPhe estavam restritas ao dominio metaloprotease ou atingiam tambem o dominio ECDdisintegrina, foi feita um ensaio de adesao ao colageno tipo I, demonstrando que nao houve diferencas entre Jar, Jar-C ou Jar-oPhe para se ligar ao colageno, sugerindo que o(s) sitio(s) da Jar que causa(m) alteracoes das ILE nao seja o mesmo que atue na interacao da toxina ao colageno. A resistencia de serpentes e alguns mamiferos aos efeitos toxicos do veneno de serpentes sao conhecidos. Um desses inibidores, o BjKgn (Bothrops jararaca kininogen) isolado do plasma de Bothrops jararaca, tambem foi testado e verificamos sua efiCiência em inibir as alteracoes da ILE causadas pela Jar ou BnP1. Esse efeito foi similar ao observado quando estas toxinas foram tratadas com oPhe, apesar do BjKgn nao atuar como um quelante, seu efeito inibitorio mostrou-se associado ao dominio metaloprotease das SVMP, ja que a mistura de Jar-C e BjKgn, apresentou inibicao parcial desses eventos celulares. Em conjunto nossos dados sugerem que o dominio catalitico das SVMP sao as principais reposnsaveis pelas alteracoes das ILE, e aparentemente os dominios ECD-disintegrina e rico-cisteina destas toxinas precisam estar separados do dominio catalitico para induzir estas alteracoes. Apesar das diferencas nas atividades hemorragica e na composicao dos dominios, as tres toxinas utilizadas induziram alteracoes similares na ILE, pela expressao das moleculas ICAM-1, CD11a, CD11b e PECAM-1
Palavra-chave Animais
Metaloproteases
Inflamação
Microcirculação
Endotélio Vascular/fisiologia
Leucócitos/fisiologia
Peptídeo Hidrolases
Moléculas de Adesão Celular
Animais
Idioma Português
Data de publicação 2012
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2012. 106 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 106 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/22227

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