Avaliacao dos fatores criticos para a quantificacao da atividade da NADH ubiquinona redutase (complexo I) por espectrofotometria

Avaliacao dos fatores criticos para a quantificacao da atividade da NADH ubiquinona redutase (complexo I) por espectrofotometria

Título alternativo Assesment of key critical factors to the enzymatic assay of NADH ubiquinone reductase (complex I) mitochondrial by spectrophotometry
Autor Oliveira, Katia Klug Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo As doencas mitocondriais sao resultado de mutacoes herdadas ou espontaneas em genes do DNA mitocondrial (DNAmt) ou do DNA nuclear (DNAn) que codificam polipeptideos envolvidos na funcao mitocondrial. Essas mutacoes podem causar disfuncoes na atividade enzimatica de um ou mais dos cinco complexos respiratorios mitocondriais, afetando o processo de fosforilacao oxidativa. A defiCiência isolada na atividade do complexo I e a mais comum disfuncao mitocondrial. O diagnostico desta e de outras doencas mitocondriais e considerado critico, a variabilidade dos sintomas dificulta o diagnostico clinico e o numero elevado de genes potencialmente envolvidos dificulta um estudo molecular completo. O metodo considerado padrao-ouro para o diagnostico das doencas mitocondriais e a analise bioquimica por espectrofotometria da atividade enzimatica dos complexos respiratorios mitocondriais. Porem, a analise da atividade do complexo I apresenta algumas dificuldades, principalmente quando realizada em fibroblastos: insolubilidade do substrato (ubiquinona), presenca de atividade inespecifica em grande quantidade e inacessibilidade dos reagentes utilizados no ensaio ao complexo (localizado na membrana interna mitocondrial). O objetivo deste trabalho foi avaliar os principais fatores que interferem na analise da atividade do Complexo I por espectrofotometria: tipo de substrato analogo a ubiquinona, concentracao de proteina, modo de determinacao da atividade especifica sensivel a rotenona e modo de permeabilizacao das amostras. Neste estudo foram utilizados fibroblastos normais e uma linhagem cibrida normal (143B). Nossos resultados demonstraram que: (1) o uso da ubiquinona 1 (UQ1) como substrato analogo a ubiquinona resultou em ensaios mais lineares e em dados mais homogeneos quando comparado ao uso da decilubiquinona (DUQ2). (2) Para a obtencao da atividade especifica sensivel a rotenona, a utilizacao de ensaio unico resulta em menor variabilidade dos dados quando comparada a utilizacao de ensaios separados. (3) O uso da tecnica de permeabilizacao das membranas com congelamento e descongelamento resultou em dados com menor variabilidade ao ser comparada com o congelamento e descongelamento seguidos de choque hipotonico. Atraves dos nossos dados podemos concluir: (1) a UQ1 e um melhor substrato quando comparada com a DUQ2. (2) A atividade especifica sensivel a rotenona pode ser obtida com um unico ensaio, visando economia de amostra e tempo e (3) o uso da tecnica de congelamento e descongelamento da amostra e adequada para permeabilizacao das membranas, melhorando o acesso dos reagentes utilizados no ensaio enzimatico ao complexo I
Palavra-chave Mitocôndrias
Doenças Mitocondriais
Transporte de Elétrons
Complexo I de Transporte de Elétrons
Espectrofotometria
Idioma Português
Data de publicação 2012
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2012. 84 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 84 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/22118

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