Quantificação de ergosterol como método de confirmação do padrão de susceptibilidade de amostras de Candida tropicalis a fluconazol

Quantificação de ergosterol como método de confirmação do padrão de susceptibilidade de amostras de Candida tropicalis a fluconazol

Título alternativo Ergosterol quantitation as a tool for defining the fluconazole susceptibility pattern of C. tropicalis strains
Autor Silva, Thelma Alves da Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Colombo, Arnaldo Lopes Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Infectologia - São Paulo
Resumo Introdução: A literatura registra grande variação nos índices de resistência a fluconazol observadas em amostras de Candida tropicalis, com índices de 0 a 35%. Esta variação faz supor que o fenômeno in vitro conhecido como "trailing", que é caracterizado pela inibição parcial de inóculo na presença de drogas fungistáticas, esteja sendo interpretado como resistência. Devido a essa discrepância de resultados, Arthington-Skaggs e cols.,(1999), sugeriram a técnica de quantificação de ergosterol para determinar valores de CIMs em cepas que apresentam "trailing". Objetivos: 1.Descrever o perfil de susceptibilidade de cepas de C. tropicalis isoladas de episódios de fungemia frente a fluconazol, 2.Avaliar a prevalência de cepas de C. tropicalis com o fenótipo "low-high MICs" observados em leitura após 24 e 48 horas de incubação e 3.Utilizar a quantificação de ergosterol como ferramenta para descriminar cepas verdadeiramente resistentes a fluconazol entre aquelas com "trailing". Material e Métodos: Foram incluídas 224 cepas de C. tropicalis provenientes de episódios de candidemia que foram encaminhados ao Laboratório Especial de Micologia, durante o período de 2000 a 2005. Após triagem de C. albicans, utilizando-se meio cromogênico CHROMagar- Candida, os isolados de Candida não-albicans foram identificados por análise do perfil bioquímico pelo método comercial ID32C e análise de microcultivo. O perfil de susceptibilidade das amostras frente à fluconazol foi realizado pelo método de microdiluição em caldo, de acordo com a normatização do documento do CLSI M27-A2 (2002). Os valores de CIMs foram obtidos nas leituras após 24 e 48 horas de incubação, utilizando critérios visuais e espectrofotométricos. A metodologia padrão utilizada para quantificar ergosterol de células fúngicas foi realizada de acordo com a técnica desenvolvida por Arthington-Skaggs e cols., 1999. Resultados: O perfil de susceptibilidade das 224 cepas de C. tropicalis frente à fluconazol foi analisado pelo método de microdiluição em caldo, de acordo com o documento CLSI M27-A2 (2002). Com relação às leituras realizadas após 24 horas de incubação, os valores de CIM50 foram de 0,5µg/mL para a leitura espectrofotométrica e 1,0 µg/mL para a leitura visual. Já os valores de CIM90 foram de 4,0µg/mL para a leitura espectrofotométrica e 8,0 µg/mL para leitura visual. Com relação às leituras realizadas após 48 horas de incubação, os valores de CIM50 e CIM90 foram de 2,0µg/mL nas duas leituras e os valores de CIM90 foram de 8,0µg/mL também nos dois critérios de leitura. Houve uma concordância entre os resultados das leituras visual e espectrofotométrica de 96,87% e 98,21% após 24 e 48 horas de incubação, respectivamente. O fenômeno de trailing esteve presente em apenas 87 (38,83%) isolados após 24 horas de incubação, sendo que destas 9 (10,35%) foram classificados como trailing moderado/intenso. Já em relação às leituras realizadas após 48 horas de incubação, 118 (52,67%) isolados apresentaram crescimento de trailing e 32 (27,11%) foram classificados como trailing moderado/intenso. Todas as 20 (8,92%) cepas que apresentaram valores CIMs ≥16µg/mL em qualquer leitura após 24 horas de incubação foram submetidas à quantificação de ergosterol de suas membranas, em ensaios com exposição a diferentes concentrações de fluconazol. Destes 20 isolados, 17 (85%) foram considerados sensíveis (CIMs ≤4µg/ml) e apenas 3 (15%) isolados foram considerados resistentes (CIMs ≥64µg/ml) pela técnica de quantificação de ergosterol. Conclusões: 1. As leituras visuais e espectrofotométricas de ensaios com fluconazol apresentam grande semelhança de resultados; 2. O fenômeno de trailing moderado/intenso é muito freqüente com cepas de C tropicalis, dificultando a interpretação dos resultados; 3. A grande maioria (85%) das 20 amostras inicialmente identificadas como resistentes nos ensaios de microdiluição apresentaram redução de ergosterol em suas membranas quando expostas a droga, mostrando tratar-se de trailing; 4. Tais dados sugerem que a ocorrência de cepas de C. tropicalis verdadeiramente resistentes a fluconazol seja bem menos freqüente que o sugerido na literatura.

Introduction: Recently, C. tropicalis resistance to fluconazole has been highlighted as a problem around the world. A large variation on resistance rates was mentioned in previous reports and it may be in part related to the phenomenon "trailing". The term ‘trailing’ has been used to describe the reduced but persistent growth that some isolates of Candida albicans and Candida tropicalis exhibit in susceptibility testing with azole antifungal agents, such as fluconazole. Arthington-Skaggs et al., (1999), suggested the technique of quantification of ergosterol content to determine values of MIC in strains with “trailing” growth. Objectives: The aims of this study were: 1. to evaluate the antifungal susceptibility profile of C. tropicalis bloodstream isolates to fluconazole, 2. to evaluate the prevalence of isolates with the low-high phenotype and 3. to use the quantification of ergosterol content as tool to identify strains truily resistant to fluconazol. Materials and Methods: We obtained a collection of 224 samples of bloodstream C. tropicalis strains isolated between 2000 to 2005. After initial screening for Candida albicans in chromogenic medium CHROMagar® Candida, the samples of non-albicans Candida species were identified based on their micromorphology and biochemical profile evaluated by the commercial system ID32C. The susceptibility testing of clinical isolates was performed by the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) broth microdilution method. The methodology standard used to quantify the ergosterol content was performed in accordance with Arthington-Skaggs et al., 1999. Results: MIC50 values at 24 hours of incubation was 0,5µg/mL by spectrophotometric reading and 1,0 µg/mL by visual reading. MIC90 values at 24 hours of incubation was 4,0µg/mL by spectrophotometric reading and 8,0 µg/mL by visual reading. After 48 hours of incubation, the MIC50 and MIC90 were 2,0µg/mL and 8,0µg/mL for both readings. The rates of agreement between the visual and spectrophotometric readings were 96,87% and 98,21% after 24 and 48 hours of incubation, respectively. The 20 (8.92%) strains that at 24 hours of incubation exhibited MIC values ≥16µg/mL in any reading were submitted to the quantification of ergosterol content. Seventeen (85%) of these 20 isolates tested were considered susceptible to fluconazole (MICs ≤4µg/ml) and only 3 (15%) isolates were considered truly resistant (MICs ≥64µg/ml). Conclusions: 1. Visual and spectrophotometric readings of fluconazole susceptibility testing presents similarity of results; 2. The phenomenon of moderate/intense “trailing” is very frequent with strains of C. tropicalis, making it difficult to interpret the results; 3. The great majority (85%) of the 20 samples initially identified as resistant in the microdilution method showed reduction of ergosterol content when exposed to the drug, having shown to be susceptible; 4. This data suggest that the occurrence of Candida tropicalis truly resistant to fluconazole is less frequent than suggested in the literature.
Palavra-chave Ergosterol
Candida
Fluconazol
Idioma Português
Financiador Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Data de publicação 2006
Publicado em SILVA, Thelma Alves da. Quantificação de ergosterol como método de confirmação do padrão de susceptibilidade de amostras de Candida tropicalis a fluconazol 2006. 90 p. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2006.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 90 p.
Direito de acesso Acesso aberto Open Access
Tipo Dissertação de mestrado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/21202

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Nome: Publico-21202.pdf
Tamanho: 1.398MB
Formato: PDF
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