Clonagem, obtencao e caracterizacao de heparinase recombinante

Clonagem, obtencao e caracterizacao de heparinase recombinante

Título alternativo Cloning, obtainment and characterization of recombinant heparinase
Autor Rotger, Tabata Smaniotto Roschel Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo A producao de enzimas purificadas que degradam glicosaminoglicanos com alta especificidade e realmente importante na determinacao da estrutura desses compostos. A heparinase e uma liase produzida por Flavobacterium heparinum. Em nosso estudo, o segmento inteiro do DNA da heparinase foi obtido a partir da Flavobacterium heparinum i atraves, de reacao del PCR usando' 'primersj especificos baseados na heparinase clonadal Os produtos de PCR foram ligados no vetor pGEM-T e submetidos a analises que demonstraram alto grau de homologia com a heparinase clonada Foi inserido o DNA da heparinase no plasmideo de expressao pGEX-2TK, usando os sitios de restricao Bam HI e Eco RI. A heparinase foi, entao, clonada in frameo com a glutationa sulfotransferase utilizando-se o sistema de expressao GST. O plasmideo recombinante foi usado para transformar a bacteria BL21 Apos a inducao com IPTG, a expressao da heparinase foi analisada por SDSPAGE A heparinase recombinante foi imobilizada em 'beads de glutationaSepharose. A atividade enzimatica da heparinase recombinante foi determinada por analises dos produtos obtidos apos a diGestão com heparinase asando' cromatografia em I papel Tetrassacarideo insaturado pentassulfatado e dissacarideo insaturado trissulfatado foram os produtos observados apos a diGestão com a heparinase recombinante acoplada a resina de Glutationa Sepharose O extrato bruto obtido da, BL21 tambem apresentou atividade especifica de heparinase Esta nova tecnologia possibilita o uso do extrato bruto da BL21 e umas producao da heparinase em larga escala, sem outras liases contaminantes. Outra vantagem e o fato de que esta metodologia e rapida, comparando com a purificacao bioquimica da heparinase a partir do extrato bruto da Flavobacterium heparinum
Palavra-chave Glicosaminoglicanas
Heparina
Heparina Liase
Flavobacterium
Idioma Português
Data de publicação 2003
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2003. 88 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 88 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Dissertação de mestrado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/19832

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