BbCI, inibidor de cruzipaína de Bauhinia bauhinioides: isolamento do cDNA e expressão heteróloga

BbCI, inibidor de cruzipaína de Bauhinia bauhinioides: isolamento do cDNA e expressão heteróloga

Alternative title BbCI, a cruzipain inhibitor of the Bauhinia baujinoides: isolation of it's cDNA an heterrologous expression
Author Hansen, Daiane Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Sampaio, Misako Uemura Autor UNIFESP Google Scholar
Abstract O BbCI (Bauhinia bauhinioides Cruzipain Inhibitor) e um inibidor de cisteinoproteinase que mostra alta identidade sequencial com inibidores de planta do tipo Kunitz, porem nao apresenta nenhum residuo de cisteina. A inibicao da cruzipaina faz do BbCI um instrumento biotecnologico interessante no desenvolvimento de uma nova geracao de drogas para o combate a infeccoes causadas pelo Trypanossoma crua 0 BbCI tambem apresenta uma atividade inibitoria para HNE (Human Neutrophillus Elastase) enzima envolvida em varios processos fisiopatologicos. 0 gene codificante para BbCI foi clonado por RT-PCR usando oligonucleotideos degenerados, os quais foram sintetizados a partir da sequencia proteica previamente descrita. 0 produto amplificado foi inserido no vetor pGEM-T para sequenciamento. Uma vez confirmada a sequencia, oligonucleotideos internos foram sintetizados para a realizacao do RACE 5' e 3'(Rapid Amplification of cDNA Ends). A informacao gerada mostrou que o BbCI e inicialmente sintetizado como uma pre-pro-proteina apresentando a seguinte estrutura: 19 residuos de aminoacidos na regiao N-terminal, 164 residuos correspondentes a proteina nativa e 10 residuos na regiao C-terminal. A sequencia correspondente a cadeia madura foi subclonada no vetor de expressao pET-28a (Novagen). 0 BbCI foi produzido por expressao heterologa fusionado a uma sequencia de 6 residuos de histidinas com um sitio de clivagem de trombina entre eles. A expressao em E. coli BL21 (DE3) produziu o inibidor em grande escala o qual foi purificado por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA SuperFlow. A proteina de fusao foi submetida a clivagem com trombina e posteriormente purificada em gel filtracao Superdex 75a(au)
Keywords Inibidores de proteases
Cisteína endopeptidases
Clonagem molecular
Bauhinia
Language Portuguese
Date 2004
Published in São Paulo: [s.n.], 2004. 91 p.
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 91 p.
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/18804

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